分子生物学技术在环境污染治理中的应用

分子生物学技术在环境污染治理中的应用摘要:本文综述了应用于污染治理中的各项分子生物学技术，包括基因工程技术、DNA序列计算分析、电泳分离纯化技术、核酸探针检测技术及聚合酶链式反应技术等，并介绍了分子生物学技术在生物修复、污染环境中生物种群动态分析、污染环境的监测等方面的应用。关键词:分子生物学技术；环境污染治理；进展概述：分子生物学是研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，经过几十年的迅速发展已成为人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。分子生物学的研究内容包含四个方面：DNA重组技术，基因表达调控研究,生物大分子的结构功能研究,基因组、功能基因组与生物信息学研究。随着分子生物学的迅速发展,相关的研究技术日臻完善，几乎渗透到生命科学的全部领域。随着工农业的发展，世界范围内的环境污染日益严重，生态平衡不断被破坏。污染问题严重威胁人类和其他生物的正常生存发展，导致资源环境中生物重组，使物种的分布与多度均发生深刻变化，已成为世界各国都面临的一大难题。近年来,各国都加大力度进行环境污染的治理研究。随着研究的深入，污染治理已逐渐由宏观向微观研究深入发展，要求的精确性日益增强，目前已发展到在分子水平上研究生物体吸收、迁移、积累有害物质，最终被毒害及适应、抗性等生态问题、生态过程的分子机制。随着分子生物学技术的日臻完善，分子生物学技术越来越多的被引入到污染治理的研究中。利用分子生物学技术已揭示了许多污染生态学中的重要机理，同时，先进的分子生物学技术也为环境监测、污染环境的治理和生物修复等应用技术提供了更快速、更灵敏、更科学的依据与方法，从而极大地推进了污染治理的实践进展。1.1基因工程技术基因工程是指按照人为创造的蓝图，将某特定的基因，通过载体或其他手段送入受体细胞，通过一系列复杂的生物学过程(类似工程操作)定向改造受体生物，使特定基因在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。用基因工程的方法，可以不受物种亲缘关系的限制而将一个外源基因导入受体细胞，经过基因重组、增殖并得到表达，产生新的基因产物。基因工程技术在环境污染物处理中的应用主要是应用改良后的基因工程菌处理污染物，如处理石油污染、降解塑料污染等。主要优点有：集中及创造目的基因，提供综合性代谢新污染物的通路和杂种细胞：提高代谢通路结构基因的表达，针对新的污染物，改变表达的调节方式：控制降解途径的限制性步骤，提高分解代谢酶的合成或其他生化反应过程效率：防止有毒污染物的产生，防止非需要产品的出现，用确定的基因实现最初的目的。1.2DNA序列计算分析20世纪后期，基因组学及后基因组学的迅猛发展，从数量上和质量上极大地丰富了生物科学的数据资源。科学家利用计算机及生物信息分析软件处理这些海量的数据资源，确定大分子序列、结构、表达模式和生化途径与生物数据之间的关系，区分生物个体间遗传差异及揭示DNA多样性。随着荧光标记核酸自动测序仪的普遍使用和生物信息学的飞速发展，已有多个国家和国际科研组织建立了生物信息数据库，并已研究出一整套的序列和结构分析工具、注释工具、基因表达分析工具以及生化和分子途径分析工具及专门的序列数据库软件供序列分析比较。基因的序列分析可揭示出生物物种之间的关系,在污染治理研究中可用于生物基因组特殊区域或特异基因的测序。1.3电泳分离纯化技术在外电场的作用下，带电颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。电泳技术是当前核酸研究中最常用的方法，具有简单、快速、灵敏、成本低等优点。除了常用的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭染色方法和聚丙烯酰胺凝胶电泳银染的方法外，还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记。如单细胞凝胶电泳、变性梯度凝胶电泳等，都是通过施加不同染色体变性条件改变DNA双螺旋结构。由于不同序列的DNA片段变性时解链程度不同，在凝胶中电泳迁移速率不同，凝胶电泳后不同序列的DNA片段在凝胶上得以高分辨率的分离，可用作各种分子标记物的检测。(1)单细胞凝胶电泳：包埋在琼脂糖凝胶中的细胞在中性或碱性条件下经裂解与解旋后，带负电荷的DNA游离断片在电场的作用下向阳极迁移。根据电泳条件，单细胞凝胶电泳可分为中性和碱性单细胞凝胶电泳。此技术灵敏、快速、简便、省时，适用范围广，所需样品少，设备简单，无需同位素标记，能反映细胞群体中不同类型细胞对作用因素的不同反应，但操作方法及评价结果没有标准化。单细胞凝胶电泳除可检测DNA单、双链断裂外，还可检测DNA切除修复缺陷和DNA交联、氧化性损伤等多种类型的DNA损伤,是探讨遗传毒性机理的有效工具。此技术灵敏度高,被广泛应用于一般环境、职业环境及室内环境的监测。(2)变性梯度凝胶电泳：变性梯度凝胶电泳是依靠变性剂使Tm值不同的分子分离。此技术分辨率高，但需较长的凝胶和电泳时间。在变性梯度凝胶电泳技术应用到分子微生物生态学后，已证明这类电泳技术是揭示自然环境中的生物群体遗传多样性的有效手段，可用于研究污染环境中的生物群落结构及监测环境变化。(3)温度梯度凝胶电泳：温度梯度凝胶电泳是依靠温度梯度来分离Tm值不同的分子，是使用热作为一种能量来源，使得氢键变得热力学不稳定，不同DNA片段由于Tm值不同将表现出不同的解链行为，从而使电泳迁移速率不同，而达到在温度梯度电泳中分离的效果。(4)单链构象多态性：在非变性的条件下，单链DNA具有一定的折叠结构，这种折叠结构是由它的核酸序列决定的。单链构象多态性是依靠核苷酸序列的不同而进行分离的。此方法操作简单、经济、适用面广。1.4核酸探针检测技术核酸探针检测技术属于一类分子标记技术，利用能与特定核苷酸序列发生特异性互补的已知核苷酸片段作探针分析DNA序列及片段长度多态性，被标记的探针根据碱基互补配对原则，可直接用来探测溶液中细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。被放射性或非放射性元素标记的探针以原位杂交、Soutnern印迹杂交、斑点印迹和狭线印迹杂交等不同的方法，可直接用来探测溶液中、细胞组织内或固定在膜上的同源核酸序列。由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的高度灵敏性，使得核酸分子杂交技术广泛应用于对环境中微生物的检测，定性、定量分析它们的存在、分布、丰度和适应性等研究目标。DNA标记直接提供了遗传物质的信息，因而被广泛应用。以mRNA为基础的分子标记能更灵敏地反映污染条件对生物的作用，反映变异水平高。1.5聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)技术模仿生物体内DNA的复制过程,首先使DNA变性，两条链解开：然后使引物模板退火，二者碱基配对：耐高温的TaqDNA聚合酶即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板链互补的DNA新链。PCR技术可在体外快速扩增DNA，具有快速、简便、灵敏度高的特点，能够弥补DNA分子直接杂交技术的不足。PCR技术的产生是整个分子生物学领域的一次重大革命，发展极快，已衍生出一系列相关的生物技术。污染治理中应用的基于PCR的技术如下：(1)反转录PCR技术(RT-PCR)：是在mRNA反转录之后进行的PCR扩增，可以用来分析不同生长时期的mRNA表达状态的相关性，探测和定量个体结构基因表达。RT-PCR技术可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物，此技术用途广泛且灵敏度高。(2)竞争PCR(C-PCR)：是一种定量PCR,通过向PCR反应体系中加入人工构建的带有突变的竞争模板、控制竞争模板的浓度来确定目的模板的浓度，对目的模板作定量研究。竞争性PCR可被用来测定受多环芳烃污染的沉降物中的编码邻基二酚-2,3-加双氧酶的dmpB基因浓度。(3)AFLP标记，先用限制酶消化DNA，然后连接上人工合成的双链接头，最后进行PCR和电泳显示。此技术是用一个短的随机引物进行PCR，模板DNA有多个扩增子，可以扩增出多个产物而可能出现多态现象。(4)扩增的rDNA限制酶切分析技术(ARDRA)，此技术依据原核生物rDNA序列的保守性，将扩增的rDNA片段进行酶切,然后通过酶切图谱来分析菌间的多样性，是美国最新发展起来的一项现代生物鉴定技术。(5)随机扩增多态DNA(RAPD)：这是一种基于PCR检测PCR引物结合位点的序列改变的方法。RAPD通常以10bp的寡核苷酸序列为引物，对基因组DNA随机扩增,电泳分离染色扩增产物，再分析多态性。(6)RAP-PCR：该技术基于任意寡核苷酸引物与RNA之间可能的配对。这样的相互作用在低严谨度条件下经聚合酶催化使链延伸。细胞总RNA或mRNA作为反转录反应的模板。此技术结合SSCP，用非变性胶分辨大小相同而构象不同的片段，以及点突变的检测。RAP-PCR技术可用于诊断遗传突变及分析污染条件下序列的多态性。此技术要求RNA量少且不受少量基因组双链DNA污染的影响。1.6酶联免疫吸附测定技术(简称ELISA)ELISA是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定技术，其核心技术是抗原抗体的特异性反应。ELISA法是在荧光免疫和放射免疫分析的基础上发展起来的，它将具高度特异性抗原抗体反应结合酶对底物的高度催化效应，对受检样品中的酶标免疫反应的试验结果，采用现代光学分析仪器进行光度测定。此技术特异性强,灵敏度高，因而被广泛应用于检测污染物的残留中，其中以测定农药残留表现最为活跃。有些发达国家如美国、德国已开发出商品检测试剂盒应用于食品、蔬菜和环境中的农药残留的检测分析。1.7ＤＮＡ微阵列技术DNA微阵列技术可用于基因克隆和基因诊断。DNA微阵列技术是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列作为cDNA芯片，cDNA芯片可作为探针检测载体上的样品序列。待DNA样品先除去中等或高度重复序列，再用机械手把极微量的DNA样品点到玻片或其他载体上,照射紫外光使之永久固定。在一定条件下，cDNA芯片载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。DNA微阵列技术主要应用于杂交测序、单核苷酸多态性分析和突变检测。结语分子生物学技术能在分子水平上揭示生物体吸收、迁移、积累有害物质，最终被毒害及适应、抗性等生态问题、生态过程。同时，先进的分子生物学技术也为环境监测、污染环境的治理、污染环境的生物修复等提供了更快速、更灵敏、更科学的依据与方法，从而极大地推进了污染治理的实践进展。随着分子生物学技术的进一步发展成熟，分子生物学技术越来越多的被引入到污染治理的研究中，其在环境污染治理中的应用将更为广泛，提供更多的研究方法与解决途径。在污染治理的应用性研究中，必须注意微观与宏观相统一，注重探索不同分子生物学技术的结合补充，还应注重结合其他学科进行研究，才能透彻理解污染过程和污染对种群变异性的影响，才能真正揭示污染发生的规律，最终彻底地解决污染问题。随着分子生物学技术的不断发展与完善，分子生物学技术将在环境污染治理中发挥越来越大的作用。参考文献:[1]朱玉贤,等.现代分子生物学[M].北京:高等教育出版社,2002.[2]王镜岩,等.生物化学[M].北京:高等教育出版社,2002.[3]沈萍.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000.[4](英)D.R.韦斯特海德,等.王明怡,等译.生物信息学[M].北京:科学出版社,2004.[5]杨业华.分子遗传学[M].北京:中国农业出版社,2001.[6]周培,陆贻通.农药酶联免疫检测技术研究进展[J].环境污染与防治,2002,24(4):248-251.[7]郑金来,等.苯胺、硝基苯和三硝基甲苯生物降解研究进展[J].微生物通报,2001,28(5):85-88.[8]顾继东.国外环境生物技术的发展和展望[J].生物技术通报,1999,(6):8-12.