分子生物学技术在食源性微生物检测中的应用胡竞进

分子生物学技术在食源性微生物检测中的应用(浙江大学生物系统工程与食品科学学院胡竞进11513021)摘要：食源性微生物污染是食品安全中最突出的问题之一,对人们的健康有着深远的影响。然而，传统的食源性微生物检测方法繁琐复杂、周期较长,因此以分子生物学技术为代表的快速、简便、特异的检测方法成为研究的热点。本文介绍了以聚合酶链式反应、基因探针检测法、变形梯度凝胶电泳、基因芯片、随机引物扩增多态性等分子生物学技术在食源性微生物检测中的应用，为今后进一步研究和开发新检测技术提供一些参考。关键词：食源性微生物；分子生物学技术；聚合酶链式反应；基因探针；变性梯度凝胶电泳；基因芯片；随机引物扩增多态性ApplicationofmolecularbiotechnologyinfoodbornemicroorganismsdetectionCollegeofBiosystemsengineeringandFoodScience11513021JingJinHuAbstract:Thepollutioncausedbyfoodbornemicroorganismsisoneofthemostdominantissueforfoodsafety,whichhasdeeplyaffectedthepublichealth.However,traditionalmethodsfordetectionoffoodbornepathogensarequitecomplex,andcostmuchtime,soincreasingnumberresearchesfocusonthequick,convenientanddifferentialmethodssuchasmolecularbiotechnology.Thisarticleintroducedseveralmolecularbiotechnologywhichcommonlyusedindetectionoffoodmicroorganismsincludingpolymerasechainreaction(PCR),geneprobe,denaturinggradientgelelectrophoresis(DGGE),genechip,randomamplifiedpolymorphismDNA(RAPD),aimingtoprovideareferenceforthefurtherstudy.Keywords:foodbornemicroorganisms;molecularbiotechnology;PCR;geneprobe;DGGE;genechip;RAPD微生物污染是诸多食品安全问题中最突出的环节之一，一方面因为微生物个体小、生长快、分布广、种类多，易于在食品生产、运输、销售过程中造成污染；另一方面，微生物在污染食品后其菌体本身以及产生的毒素等代谢产物会对食品本身造成品质的破坏使其失去使用价值造成经济损失，并会对误食者造成健康上的损害甚至生命的威胁。据世界卫生组织(WHO)统计,全世界每年发生食源性疾病数十亿人,甚至在发达国家,也有三分之一的人群每年遭受食源性致病菌的侵袭。因此，食品微生物检测对于保障食品安全起着及其重要的作用。传统的食源性微生物检测和鉴定方法主要有分离培养鉴定法、生化鉴定、酶联免疫吸附法(ELISA)及自动酶联荧光免疫检测方法、电阻抗测量法、放射测量法、生物发光法、直接外荧光过滤技术、色法等物理和化学的方法。传统的微生物检测方法虽然有效，但存在速度慢、成本高、效率低等问题,例如，需要5一7天的培养鉴定时间,不能实现快速检测；微生物的生化特征以及生化试剂的不稳定,经常鉴定的结果不准确、重复性差。因此，传统的检测方法越来越难以满足现代社会快速检测的要求。随着细菌基因组学和分子生物学技术的飞速发展，诞生了许多准确度和灵敏度高、特异性强、操作简便、检测周期短、效率高的分子生物学技术，它们越来越广泛地应用于食源性微生物的检测。本文对在食品病原微生物检测中常用的几种分子生物学技术原理及应用。1聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）美国人Mullis于1985年发明了PCR技术，并荣获了1993年诺贝尔化学奖。PCR现在已成为生命科学领域最常用的分子生物学技术之一，它是一种体外酶促合成DNA片段方法，由变性、退火和延伸等几步反应组成一个循环，重复进行，最终使目的DNA以指数级迅速扩增。常规PCR反应体系中包括模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTP、Mg2+及缓冲液等成分。与传统的微生物检测方法相比，PCＲ具有以下特点:(1)灵敏度高:病毒检测的灵敏度可达3个RFU，细菌检测的最小检出率为3个细菌；(2)特异性强:对不同微生物型进行准确鉴定；(3)操作简便省时:一般1～2h就可完成检测。1.1多重PCR多重PCR又称多重引物PCR，其基本原理和操作程序与常规PCR相同，只是在反应体系中加入多对特异性的引物,可同时检出多种致病菌或对同一致病菌的多个亚型进行分类，也可以通过检测微生物的致病性基因判断微生物的致病性。多重PCR可以显著提高检测效率和降低检测成本，在食品、药品微生物检测领域得到了广泛的应用。卫沛楠等建立的针对金黄色葡萄球菌9种肠毒素的多重PCR方法检快速、简便，且特异性较高，较传统方法有明显的优势[1]；滕要辉等建立的多重PCR方法经过4h的增菌培养即可从速冻水饺中同时检出起始菌数100CFU·g1的沙门菌和金黄色葡萄球菌，且特异性为100%[2]；张政等用金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽孢杆菌DNA作为模版建立多重PCR方法，在6h内即可完成检测，检出限达到104CFU·mL1[3]；强世龙等根据副溶血性弧菌tdh、tl基因设计引物用双重PCR技术快速检测新鲜海水贝类样品中副溶血性弧菌，该方法的最低检出限为2.5×102cfu/mL，模拟污染样品的检测限为10cfu/g，且与国家标准方法的检测结果一致[4]；杨平等针对食品中金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、沙门氏菌和单增李斯特菌建立的多重PCR检测方法，只需经过4～8h增菌即可检测，最低检出限可达1cfu／mL[5]；Yang等基于多重PCR建立了对食品中鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157：H7和单增李斯特菌的快速检测方法，其纯菌落的检测限分别达1.2×102cuf/mL、4.0×102cuf/mL和5.4×102cuf/mL）[6]；范宏英等运用多重PCR技术成功的建立了沙门氏菌、志贺氏菌、肠出血性大肠杆菌O157、绿脓杆菌和副溶血弧菌5种饮用水中致病菌的同时快速方法[7]。与传统检测方法相比，多重PCR检测法大大缩短了检测时间和样品量，同时提高了结果的准确性和可重复性。1.2免疫捕获PCR(immuno-capturePCR，IM-PCR)IM-PCR技术是一种把抗原抗体反应和PCR技术相结合、用于检测微量抗原的新技术,由抗原抗体的免疫反应和常规的PCR反应组成。该技术既保留了抗原抗体反应的特异性，又应用了PCR技术的高度灵敏性,具有高度特异性、快速检测、易于操作、成本低廉等优点。夏俊芳等应用免疫捕获PCR方法特异性的检测了2株金黄色葡萄球菌，且在对5种食品模拟带菌检测时发现，该方法无需培养，检测的灵敏度可达到2.35×103CFU·mL1，是常规PCR检测灵敏度的100倍[8]。1.3实时荧光定量PCR(real-timePCR)常规的PCR很难根据PCR的扩增终产物计算起始模板的拷贝数，即无法对初始模版进行定量分析。而荧光定量PCR技术(real-timequantitativePCR，RT-PCR)在反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累对整个PCR全过程进行实时监测，通过标准曲线可对未知模板起始浓度进行定量。高正琴等建立的特异性检查支原体的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法，检测灵敏度达9.2拷贝，且与空肠弯曲菌、肺炎克雷伯杆菌等8种细菌均无交叉反应，为动物源性药品和生物制品中支原体的快速检测提供了实用的方法[9]；Herbel等利用荧光定量PCR技术特异性检测出酸奶中乳酸杆菌的浓度为105CFU·mL1，能够完全满足商品中益生菌浓度检测的需要(通常检测范围为106~1012CFU·mL1)[10]；徐杨等用鲍鱼管家基因16SrRNA基因设计特异性引物和探针，建立的鲍鱼过敏源基因成分实时荧光PCR快速检测方法具有良好的特异性和灵敏度[11]；刘继超等以SED基因为肠毒素D的检测靶序列，设计荧光定量PCR引物和TaqMan探针，建立了TaqMan探针荧光定量PCR方法对乳中产肠毒素D金黄色葡萄球菌进行快速检测，具有良好的应用前景[12]；2010年,程晓燕等建立的SYBRGreenI实时荧光定量PCR检测对虾白斑综合征病毒的方法,取得了较好的实现效果[13]。2基因探针检测方法华盛顿卡内基学院的Britten等于1968年利用碱基配对原理使互补的2条核酸单链通过退火形成双链创建了基因探针技术，又称核酸分子杂交技术。基因探针技术是现代DNA分析方法的基础，已经广泛应用于食品微生物的检测中，能排除非致病性微生物的干扰，灵敏、快速、直接地检测出致病性微生物[14,16]。通过分离和标记病原体独特的核酸片段就可制备出探针，利用带有标记物的已知序列的核酸探针与待测样品进行杂交，最后使用特定的方法测定标记物，便可确定样品中有无特定病原体。Moseley等用生物素标记沙门菌基因片段制作探针检测食品中的沙门菌取得了良好的效果；Kerdahi等使用自动化酶连接的非放射性DNA探针，迅速准确地检测出了单核细胞增生李斯特菌[17]；陈倩等使用针对ESIEC大肠杆菌HPI毒力岛基因设计的rp－z探针，成功地鉴定出了ESIEC大肠杆菌[18]。此外，商品化的基因探针试剂盒也已经问世，例如：美国GENE－TRAK公司研制出了脱氧核糖核酸杂交筛选比色法，主要利用特异的基因探针对沙门菌、李斯特菌和大肠杆菌的rRNA进行检测；法国梅里埃公司研制的GENE－PROBE系统采用杂交保护分析法对食品中的金黄色葡萄球菌进行检测[19]。目前已可以用DNA探针检测食品中的大肠杆菌(Escherichiacoli)[20]、沙门氏菌(Salmonella)[21]、志贺氏菌(Shigellaspp)（BeiAK,DicesareJC,HaffL.Appl.Environ.Microbiol.,1991(57):1013～1017）、耶希氏菌(Yersiniaenterocolitica)[22]、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)[23]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[24]等。Wang等对用DNA探针杂交技术检测食品中13种常见的致病菌的一般方法进行了概述[25]。基因探针检测技术不仅具有特异性、灵敏度高的优点，而且兼备组织化学染色的可见性和定位性。目前核酸探针在食品微生物检测中主要应用于以下几个方面：（1）检测无法培养或无法生化鉴定、产物不可观察的微生物以及诊断抗原缺乏病原体的检测。（2）用于检测病毒。（3）用于流行病学调查研究，区分有毒和无毒菌株。（4）检测细菌内抗药基因（5）分析食品是否会被某些耐药菌株污染，判定食品污染的特性。3变性梯度凝胶电泳（denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE）变性凝胶梯度电泳(DGGE)是在聚丙烯酰胺凝胶中加入变性剂(尿素和甲酰胺),电泳时因为双链DNA分子会所含碱基对不同,导致解链的温度有差异,导致DNA分子在凝胶中的存在位置不同,形成不同的条带,只要把电泳的条件改变的足够精细,就能把具有碱基差异的DNA分子分开。在食品微生物的鉴定中，先从食品中提取DNA或RNA然后进行PCR或RT-PCR的扩增，然后利用DGGE凝胶电泳最后进行谱带分析,对条带进行测序后进行系统发育分析最后分离富集。2004年J.Theunissen和TJ．Britz等人用DGGE法对南非益生茵食