分子生物学教案内容-实验

1讲次1日期2013-11-11节次1-2,3-4节授课内容实验一实验基础仪器设备及基本技能授课学时2教学目的通过板书、实物演示、操作等教学方式，让学生初步学习和掌握分子生物学实验的基本知识和基本技能，了解分子生物学实验常用仪器设备，熟悉常用仪器设备、耗材。教学重点分子生物学实验的基本技术和技能，分子生物学实验中常用的仪器设备使用方法及注意事项。教学难点分子生物学实验中常用的仪器设备使用方法及注意事项。教具和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、操作演示法教学过程课程介绍5分钟新课讲授90分钟1.分子生物学实验规程2.分子生物学实验设备1)温度控制系统：冰箱：4℃、-20℃、-70℃--样品、试剂和材料等的保存2)恒温培养箱：细菌平板的培养3)恒温空气摇床；菌体的培养4)灭菌器:培养基、试剂、耗材等的灭菌5)PCR仪：PCR扩增、保温实验等6)恒温水浴及微量加热器：保证实验温度的恒定7)电泳仪：电泳时提供电压和电流8)电泳槽：核酸或蛋白质的电泳定性分析时的凝胶支架9)凝胶成像系统：电泳结果的定性和定量分析10)紫外分析仪：电泳结果的定性分析11)台式高速冷冻离心机：样品的分离12)分光光度计：样品的定量测定13)超净工作台：提供洁净工作环境14)pH计：精确的pH值测定15)移液器；液体试剂的精确取量16)制冰机：保证操作过程中温度的恒定总结5分钟思考题1、完成一篇分子生物学实验安全预案。2讲次2日期2013-11-13节次1-2,3-4节授课内容实验二实验准备及实验规范训练授课学时2教学目的学会分子生物学常用仪器设备的使用方法和试剂的配制方法，配制实验三所需的药品教学重点分子生物学常用仪器设备的使用方法和试剂的配制方法教学难点配制实验三所需的药品教具和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程上节课程总结5分钟新课学习90分钟1.分子生物学实验仪器训练学生以小组为单位，操作分子生物学主要实验仪器。2.分子生物学基本技术2.1实验规范训练－仪器的操作要求：①仪器在未经培训前，不得擅自使用②严格按操作规程使用仪器，③有些仪器必须有教师在场时才能使用，并由教师操作④违反规定的使用者，造成的后果由使用者承担2.2实验规范训练－量程的选择①天平②烧杯、量筒、容量瓶、试剂瓶－－不同规格③量程的选择－移液器2.3实验规范－实验操作①详细记录和分析实验结果并按时提交实验报告②实验中一定要处处用心、勤动手，多问为什么③仔细操作和观察④保留好每一步的实验样品，在确准的情况下才能当废液扔掉33.配制试剂：蛋白酶K购自美国Promega公司；Tris、EDTA、SDS、Tris饱和酚、三氯甲烷、无水乙醇、硼酸、冰乙酸等均购自北京及其他国内外化学试剂公司。提取DNA所用相关溶液的配制（试剂的配制若无特别要求，均以蒸馏水为溶剂，高压灭菌条件为121℃（1.034×105Pa）、25min）：⑴1MTris.CL（pH8.0）：称Tris121.1g,溶于800ml蒸馏水中，用磁力搅拌器搅拌，用浓HCl调pH至8.0，定容至1000ml，分装后高压灭菌。⑵0.5MEDTA（pH8.0）：称186.1gEDTA溶于800ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0，加水定容至1000ml，高压灭菌。⑶0.5MNaCL：5.844gNaCL溶于双蒸水中，定容至200ml,高压灭菌。⑷SDS（10％）：在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，用盐酸调pH至7.2,加水定容至1000ml，过滤膜过滤，室温保存，无需灭菌。⑸组织DNA提取液配方：1MTris.CL(pH8.0)5ml，0.5MEDTA(pH8.0）20ml，0.5MNaCL20ml，10%SDS10ml，双蒸水45ml。⑹蛋白酶K（20mg/ml）：200mg蛋白酶K溶于10ml双蒸水，以1ml分装，20℃冻存。总结5分钟思考题1、完成训练过程，记录仪器使用心得。2、配制试剂中出现何问题？如何处理？4讲次3日期2013-11-182013-11-20节次1-4节授课内容实验三组织基因组DNA的提取授课学时4教学目的掌握动物总DNA的抽提方法和基本原理。教学重点动物总DNA的抽提技术和基本原理。教学难点动物总DNA抽提的基本原理。教具和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程上节课程总结5分钟新课学习190分钟一、实验目的：二、实验原理：十二烷基硫酸钠(sodiumdodecylsulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得动物物总DNA溶液。三、实验材料：猪皮肤组织四、主要仪器低温冰箱，冷冻高速离心机（美国），移液器，制冰机五、步骤：用眼科手术剪将约0.3g组织块剪碎，置于1.5ml离心管里，干燥20min加入500l组织DNA提取液加入蛋白酶K至终浓度为150g/ml，充分混匀，55℃消化12-24h(以组织样消化完全，呈透明状为宜)加入等体积的Tris饱和酚，缓慢颠倒离心管10min使溶液的两相充分混匀，4℃12000rpm，离心10min转移上清至另一离心管中，重复上一步骤1～2次。5教学过程转移上清至另一离心管中，再分别用等体积的苯酚:氯仿（1:1），氯仿，4℃12000rpm，离心10min转移上清至另一离心管中，加入1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2倍体积的冰冻无水乙醇沉淀DNA，温柔的上下颠倒几次将DNA沉淀挑出，置于1.5ml离心管。将DNA自然晾干（注意不能太干，否则不易溶解）后溶入适量1×TE或超纯水中备用。（TE较超纯水要更好，可以使DNA更稳定）总结、分析5分钟思考题作业1、完成实验报告，基因组DNA提取过程中各组分的作用是什么？2、本实验操作的关键点是什么？6讲次4日期2013-11-21节次1-2，3-4节授课内容实验四琼脂糖凝胶电泳授课学时2教学目的通过本实验掌握琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。教学重点琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理和操作技术。教学难点琼脂糖凝胶电泳技术的基本原理教具和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程上节课程总结5分钟讲授25分钟一、实验目的二、实验原理琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。但是EB有致畸和致癌性，本实验中用与EB相似功能但未发现致畸和致癌性的GoldView作为核酸染料。三、实验材料及相关试剂基因组DNA，琼脂糖，50XTAE，上样缓冲液四、主要实验仪器：电泳仪、水平电泳槽、微波炉、紫外分析仪。五、实验步骤（1）制胶（以30mL为例）a.称取0.24g琼脂糖，加入30ml的1XTAE缓冲液（pH8.0），摇匀。b.微波炉上加热，至琼脂糖完全溶解；7教学过程c.用凝胶将制胶板两端封好，插入适当的梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃），加入适量核酸染料，倒入制胶板中，在室温下冷却凝固(约30~45min)；d.将制胶板置于电泳槽中，小心垂直向上拔出梳子，以保证点样孔完好。（2）点样（3）电泳打开电源开关，调节电压至130V，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，约20分钟后即可观察。（4）观察将电泳好的胶置于紫外分析仪，可见到绿色核酸条带，根据条带粗细，可粗略估计该基因组DNA的浓度。实验操作55分钟总结、分析10分钟思考题作业完成实验报告，对本组实验操作关键点及结果进行分析？8讲次5日期2013-11-252013-11-27节次1-4节授课内容实验五PCR扩增及检测授课学时4教学目的通过本实验掌握PCR反应的基本原理，PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。教学重点学习PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术检测PCR产物。教学难点PCR的基本操作技术教具和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程讲授新课25分钟一、实验目的二、实验原理PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：PCR循环过程中有三种不同的事件发生：（1）模板变性；（2）引物退火；（3）热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。1．变性：加热使模板DNA在高温下（94-95℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。2．退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。3．延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP），按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNATaq聚合酶。9教学过程三、实验材料及相关试剂基因组DNA，基因特异性引物，PCR扩增相关试剂，等四、实验仪器PCR仪，电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪、电炉五、实验步骤1．模板DNA：实验二所得基因组DNA。2．PCR操作(在冰上操作)：（1）PCR反应混合液的配制：反应体系25µL,在无菌的0.2mL离心管中按下列操作程序加样：（2）将PCR管放到PCR热循环仪中，按下列程序开始循环：94℃4min(预变性)94℃30sec,~60℃30sec,72℃30sec72℃8min30个循环3.PCR产物检测实验操作170分钟总结、分析5分钟反应物体积/µLddH2O18.210xBuffer2.52.5mmol/LdNTP210pM上游引物110pM下游引物1DNATaq聚合酶0.3思考题作业1．PCR反应液中主要成分是哪些？在PCR反应过程中各起什么作用？2．用PCR扩增目的基因，要想得到特异性产物需注意哪些事项？10讲次6日期2013-12-22013-12-4节次1-3,7节授课内容实验六SSCP技术分析基因多态性授课学时4教学目的掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。教学重点聚丙烯酰胺凝胶电泳的分析基因多态性的原理及操作技术，基因分型教学难点聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理，基因分型教具和媒体使用黑板教学教学方法讲授法、实验操作法教学过程讲授新课40分钟一、实验目的掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理及操作技术，学会用SSCP技术进行基因分型。二、实验原理聚合酶链反应-单链构象多态性分析（SingleStrandConformationPolymorphismAnalysisofPolymeraseChainReactionProducts,PCR-SSCP）是近年来发展起来的一种基因分析方法。其基本原理为：将PCR扩增产物变性为单链，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。在不含变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，DNA单链的迁移率除与DNA链的长短有关外，更主要的