分子生物学补充

基因工程是在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。第一部分基因表达基因工程的主要内容或步骤1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。（切）2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能自我复制的并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子。（连）3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（寄主细胞），并与之一起繁殖。（转、筛）4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。（扩）5、从这些筛选出的受体细胞克隆，提取出已经得到扩散的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产出人类所需要的物质。外源基因在原核细胞中的表达外源基因在真核细胞中的表达常用载体：1.Prokaryoticexpressionvector原核表达载体2.Baculovirusexpressionvector昆虫杆状病毒表达载体3.Mammalianexpressionvector哺乳动物表达载体4.Yeastexpressionvector酵母表达载体5.Adenoviralandretroviralvector腺病毒及逆转录病毒表达载体外源基因具备的条件：1.编码区不含插入序列；（mRNA-cDNA）2.位于启动子下游，方向一致，原有的读码框不变；3.含起始密码子、终止密码子；4.转录出的mRNA必须有SD序列，调整SD序列与第一个AUG间的距离（因为会对转译效率有影响）；5.产物比较稳定（如：融合蛋白、信号肽）；6.选择系统偏好的简并密码。影响外源基因表达的因素：1.启动子的强弱（主要因素）2.基因的剂量3.RNA转译效率（SD互补、AUG-SD距离及序列、AUG前后核苷酸序列的适宜性）4.密码子5.表达产物的大小6.产物的稳定性受体细胞的选择不同类型的细胞具有不同的特征，对要表达的外源基因具有不同的适应性。如：CHO细胞、CV-1或NIH-3T3选择标记特定细胞、选择标记、选择性培养基——特定的选择系统。常用的：胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因、新霉素磷酸转移酶基因选择系统等。导入细胞：•转化（transformation):指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入原核生物里面的过程。•转染(transfection):指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。•转导(transduction):转导是指通过病毒将一个宿主的DNA转移到另一个宿主的细胞中而引起的基因重组现象。（狭义：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程。）导入细胞的方法：重组体导入细胞的方法哺乳动物细胞（磷酸钙沉淀显微注射脂质体DEAE-dextran）酵母菌——电转大肠杆菌——CaCl2法制备感受态细胞，热攻击法转化重组蛋白的诱导表达及检测：1.IPTG诱导2.温度诱导3.检测:SDS-PAGE电泳第二部分蛋白质的纯化蛋白质的分离纯化的一般原则一、原料的选择：富集于哪种组织、细胞；胞外or胞内表达。组织和细胞的破碎方法：匀浆、电动捣碎、超声破碎、反复动融。细菌、酵母、哺乳动物细胞二、粗分：简单、易处理、快速。如利用蛋白质溶解度不同，在不同pH值下，不同饱和度的硫酸铵沉淀；有机溶剂分级沉淀；分级离心等。三、精制备：离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲核层析、电泳、离心、结晶以及一些免疫的方法。注意保持生物活性，如pH值、温度、加入酶的抑制剂、金属离子络合剂（EDTA）等。蛋白质的分离纯化技术：1.溶解度差别2.分子大小不同3.蛋白质分子带电性质不同4.蛋白质吸附性质不同5.蛋白质的特异性配体原理应用肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL)的表达、纯化和抗肿瘤活性研究技术路线引物设计表达载体：TRAIL全基因及可溶型sTRAIL基因PCR扩增提取正常人外周血淋巴细胞总RNATRAIL全基因的获得以该总RNA为模板，用宝生物公司的BeaBEST反转录试剂盒进行反转录。以该反转录产物为模板，加入引物P1，P2进行第一次PCR。sTRAIL基因的获得以TRAIL全基因经纯化的PCR产物为模板，加入引物P1’，P2，再次PCRsTRAIL基因，产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。含肠激酶位点的pThioHisA-sTRAIL表达载体的构建纯化后的TRAIL、sTRAILPCR产物用BamHI、EcoRI双酶切。质粒pThioHisA用同样的酶双酶切，胶回收酶切片段，T4DNA连接酶分别连接经双酶切的片段TRAIL、sTRAIL和质粒载体，转化宿主菌BL21，筛选阳性克隆。小提质粒，酶切鉴定重组子，并对重组子进行测序分析。诱导表达pThioHisA-sTRAIL在大肠杆菌BL21中的诱导表达。3.0mmol/LIPTG诱导6-8h，表达达到高峰，经薄层扫描目的蛋白约占菌体总蛋白的39％左右。表达产物部分可溶，其余形成包涵体。融合表达产物SDS-PAGE表观分子量为32000Dalton左右（实际分子量为35608.21Dalton）。sTRAIL融合蛋白的制备工程菌的培养：挑取阳性克隆，接种于200mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜。然后以10-20％的接种量扩大培养，IPTG诱导。超声破碎菌体：离心收获的菌体按0.2g/mL重悬于A液(20mmol/LTris-HClpH8.0，0.2mol/LNaCl，5mmol/L咪唑)，冰浴中超声破碎。12,000rpm/min离心15min，分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE分析目的蛋白以可溶性还是以包涵体形式存在。sTRAIL融合蛋白的纯化1.融合表达载体pThioHisA在硫氧还蛋白融和段带有组氨酸标签，用Ni2+固相化的ChelatingSepharoseFastFlow填料进行亲和层析。2.将可溶性表达产物（超声破碎菌体的离心上清）与亲和柱结合，用2倍柱床体积以上的A液过柱，至基线平稳；用B液(A液中加入咪唑至终浓度为50mmol/L)梯度洗脱5－10个柱体积，用AKATAExplore进行检测，收集各洗脱峰。sTRAIL融合蛋白的肠激酶切割及纯化1.sTRAIL融合蛋白的肠激酶切割：按sTRAIL融合蛋白：肠激酶不同体积的比例酶切，SDS-PAGE分析。2.sTRAIL非融合蛋白的纯化：以A液（25mMpH7.0的磷酸缓冲液）平衡SPSepharoseFastFlow离子交换柱，将酶切后的反应液直接上柱，以B液（25mMpH7.0的磷酸缓冲液＋0.6MNaCl）梯度洗脱，收集洗脱峰，以分离除去融合头。其中的目的峰再用分子筛SepharylS-200做进一步纯化及脱盐处理。用Bradford法测定蛋白质浓度，SDS-PAGE分析检测。sTRAIL融合蛋白及非融合蛋白的WesternBlot检测第一抗体：兔抗人TRAIL多克隆抗体，1:1000稀释；第二抗体：HRP标记的羊抗兔IgG抗体，1:10000稀释。新基因功能研究的策略与方法基因功能的研究策略主要包括：一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析;二.新基因的体内表达规律分析三.功能获得与功能失活策略研究;四.功能失活策略五.基因编码产物相互作用蛋白的研究一.新基因的生物信息学及体内表达规律分析目前，生物信息学分析已成为新基因功能研究首选和必用方法，其具有方便快捷和经济等优点。研究者往往可以从中得到与新基因功能有关的重要信息，初步推测基因的可能功能，进而制定出进一步的实验室研究方案。（1）编码产物预测分析（2）序列同源性分析（3）蛋白质功能域分析二.新基因的体内表达规律分析要开展新基因功能的研究工作，首要的研究任务摸清新基因在体内的表达规律。包括从mRNA和蛋白质两个水平上来对其基因表达谱进行分析，即看其在各种不同的正常或病态组织细胞中是否表达以及表达的水平高低等.新基因在某一特定的正常组织细胞中的表达水平高往往提示其在其中发挥着重要作用，而新基因在相应的病态组织中的表达异常则提示与该病理过程相关的生物学意义。（1）mRNA水平的表达谱分析；（2）蛋白质水平的表达分析。三.功能获得策略新基因功能研究的功能获得策略即通过将新基因直接导入到某一细胞或个体中，通过观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化来鉴定基因的功能，常用的方法有：（1）基因转染技术（2）转基因技术四.功能失活策略通过观察某一细胞或个体在新基因的功能部分或全部失活后的细胞生物学行为或个体表型遗传性状变化来鉴定基因的功能。常用的方法主要有基于核酸的基因沉默技术和基因敲除等1）基因沉默技术（2）基因敲除五.基因编码产物相互作用蛋白的研究细胞各种基本功能的完成离不开蛋白质之间的相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白质复合物。因此，确定能够与新基因编码的蛋白质表达终产物相互作用的上下游蛋白质分子，也是研究新基因功能的一个十分重要的方面。目前常用的研究蛋白质相互作用的技术包括传统的基亲和分析而建立的免疫共沉淀技术和酵母双杂交系统.（1）免疫共沉淀技术（2）酵母双杂交系统编码产物预测分析研究者往往最开始得到有价值的EST序列，进而通过电子延伸或和相关实验方法获取其全长cDNA序列。这种情况下，首先要进行即是进行全长cDNA序列的开放阅读框查找，推导其编码蛋白质的氨基酸序列。然后，进行信号肽序列预测分析。初步判定其亚细胞定位，再进行蛋白质的基本理化性质分析，包括氨基酸组成、分子质量、等电点、亲/疏水性等。最后，以已知的氨基酸序列的基础，分析预测其高级结构。序列同源性分析包括核苷酸序列同源性分析和氨基酸序列同源性分析，这也是目前生物信息学技术中应用最为广泛的基本技术之一。主要采用BLAST和FASTA程序进行，即从已知的各种核酸和蛋白质序列数据库搜索与新基因对应的功能已知的高度同源基因和蛋白质，从这些已知基因和蛋白质的功能信息中来初步推测和判断新基因的功能。同时，因为人类全基因组测序已经完成，所以以新基因的cDNA序列来对基因组数据库进行同源性比对，则可很方便地获得与其完全同源基因组DNA序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位杂交等基因染色体定位技术，进而还可通过分析其内含子、外显子序列及其调节位点，推测其可能的基因表达调控方式。即通过此法确定了富含亮氨酸重复序列蛋白新基因的基因组DNA序列及其染色体定位。蛋白质功能域分析主要是通过联网或数据库行蛋白质是基因功能的体现者和施行者，而蛋白质的结构则是蛋白质执行生物学功能的基础，因此对新基因所编码蛋白质的功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价值的信息。目前，已经有大量被发现的蕴藏于蛋白质结构中的与特定生物学活性相关的所谓保守模体mRNA水平的表达谱分析对新基因在mRNA水平上的表达分析涉及到的技术有半定量RT-PCR、实时定量RT-PCR和NorthernBlot等。半定量RT-PCR方法具有简便、快捷和经济的特点，但其存在着精确度不高和不能进行绝对定量等缺点，多用于基因表达水平的快速初步分析。实时定量RT-PCR是近年来新发展起来的一种mRNA定量分析技术，因具有特异性更强、有效解决PCR污染和自动化程度高等的特点而被广泛应用，但其成本相对较高。NorthernBlot历来是在mRNA水平上对基因表达进行分析的经典技术，被各实验室广泛采用其不仅可以进行定量分析，而且还能够检测基因转录本的大小及种类，这也是RT-PCR技术所不具备的优势但NorthernBlot操作较为繁琐，采用放射性标记时也存在放射性污染的问题。在实际工作中，需结合这两类方法同时进行，互为补充。另外，必要时也应考虑使用原位杂交技术来对新基因的mRNA在特定组织细胞内的分布进行定位观察。蛋白质的水平表达分析确定新基因在哪些组织细胞被转录后，进一步的工作则是制备相应的抗体来检测其蛋白质终产物的表达情况，如该蛋白质表达的亚细胞定位、分子质量大小、聚体形式等。这种在蛋白质水平上的表达分析涉及到的常用技术主要是WesternBlot和免疫