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1第1章绪论1.1分子生物学的含义分子生物学是研究核酸，蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征以及重要性、规律性和相互关系的科学；是人类从分子水平上真正揭开生物世界奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础科学。当人们认识到同一生物不同世代之间的连续性是由生物自身所携带的遗传物质所决定的，科学家为揭示这些遗传密码所进行的努力就成为人类征服自然界的一部分，而以生物大分子为研究对象的分子生物学就迅速地成为现代生物学领域里最具活力的科学。从广义上讲，蛋白质、核酸等生物大分子结构和功能研究都属于分子生物学的范畴。例如，蛋白质的结构、运动和功能，酶的作用机理和动力学，膜蛋白的结构、功能和跨膜运输等都属于分子生物学的研究内容。不过目前人们通常采用狭义的概念，将分子生物学的范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因的复制、表达和调节控制的过程。当然，其中也涉及到与这些过程有关的蛋白质和酶结构和功能的研究。1.2分子生物学发展简史早在1871年Miescher就从脓细胞中分离出了脱氧核糖核酸（DNA），但当时并不认为它是生物体的遗传物质。直到1944年，Avery等人才通过肺炎链球菌的转化实验证实了DNA是生物体的遗传及变异的物质。在1949年查盖夫（Chargaff）测定出了DNA的碱基组成，并确定了DNA的碱基配对规律，与此同时威尔金斯（Wilkins）及弗兰金（Frankin，1950—1952）用X—射线衍射技术测定了DNA纤维结构，指出DNA是一种螺旋结构。在此基础上Watson和Crick于1953年提出了DNA的双螺旋结构模型，为充分揭示遗传信息的传递规律铺平了道路。为此他们和Wilkins于1962年共同获得了诺贝尔生理医学奖。DNA双螺旋结构模型理论奠定了分子生物学发展的基础。DNA双螺旋模型已经预示出了DNA的复制规则。科恩伯格（Kornberg）在1956年首先在大肠杆菌的无细胞提取液中实现了DNA的合成，并从大肠杆菌中分离出了DNA聚合酶Ⅰ，并证明DNA的合成需要一个模板DNA。奥乔尔（Uchoa）发现了细菌的多核苷酸磷酸化酶，成功的合成了RNA，研究并重建了将基因内的遗传信息通过RNA中间体翻译成蛋白质的过程。他和Kornberg共享1959年的诺贝尔生理医学奖1965年，法国科学家Jacob和Monod由于提出并证实了“操纵子学说”而获得了诺贝尔生理医学奖。Jacob和Monod还首次提出存在一种与染色体DNA序列相互补，能将染色体DNA上的遗传信息带到蛋白质合成场所并翻译成蛋白质的核糖核酸，即mRNA分子。他们这一学说对分子生物学的发展起了极其重要的指导作用。Crick在1954年就提出了遗传信息的传递规律，称为“中心法则”，但RNA如何翻译成蛋白质的问题没有解决。直到1961年Yanofsky和Brener提出了三联密码的设想，后来经过尼伦伯格（Nirenberg）和马夏（Matthai）的努力，终于于1963年破译了遗传密码。霍利（Holly）阐明了2酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列，并证实所有的tRNA具有结构上的相似性。科拉纳（Khorana）（1966年）用有机化学方法合成了多聚脱氧核糖核酸，并以它为模板用DNA聚合酶Ⅰ合成DNA链，然后以DNA为模板合成了RNA。为此，Nirenberg、Holly、Khorana分享了1968年的诺贝尔生理医学奖。按照中心法则，遗传信息是从DNA→RNA→蛋白质。但是在RNA病毒中则是从DNA→ssRNA→cDNA，这个过程必须有反转录酶发挥作用。泰明（Temin）和鲍蒂毛（Baltimore）首先发现在RNA肿瘤病毒中存在反转录酶，因此他们获得了1975年的诺贝尔生理医学奖。现在，我们可以利用反转录酶，以分离得到的mRNA为模板合成cDNA，从而进行基因结构及其表达的研究。DNA是一个长链的生物分子，在研究DNA重组、表达质粒的构造，以及在DNA的碱基序列分析之前往往需要将DNA分子切割成较短的片段，这就需要一种酶来完成。史密斯（Smith）于1970年首先从大肠杆菌中分离出了第一个能切割DNA的酶。由于它能在DNA的专一位点上切割DNA分子，所以将这种酶称为限制性内切酶。目前已有数百种限制性内切酶作为商品出售，给分子生物学的研究带来了极大的方便。限制性内切酶的分离成功，使重组DNA成为可能。1972年伯格（Berg）首次将不同的DNA片段连接起来，并且将这个重组的DNA分子有效的插入到细菌细胞之中，重组的DNA进行繁殖，于是产生了重组DNA的克隆。Berg是重组DNA和基因工程的创始人。桑格（Sanger）和吉尔伯特（Gilbert）两人则于1977年分别用酶法和化学方法测定了DNA的碱基序列，从而创建了DNA碱基序列分析的方法。Sanger和Gilbert发明的DNA序列分析方法至今仍在广泛使用，是分子生物学最重要的研究手段之一。为此，Berg、Sanger和Gilbert三人共获1980年的诺贝尔生理医学奖。1984年，德国遗传学家科勒（Kohler）、美国人米尔斯坦（Milstein）和丹麦科学家杰尼（Jerne）由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔生理医学奖。酶是蛋白质，这已经是多年来人们形成的一个固定的概念，但20世纪80年代有一个惊人的发现，即一些RNA也具有催化功能。在1982年切赫（T.Cech）发现四膜虫的核糖体RNA能够自我剪接。随后在1983年底S.Altman报导了在大肠杆菌RNA前体的加工过程中起作用的RNase是由20%的蛋白质和80%的RNA组成的，在除去蛋白质部分，并提高Mg2+浓度的情况下，余留下来的RNA部分仍具有与全酶相同的催化活性，这就说明RNA具有酶活性。将这种具有催化功能的RNA称为核酶。因此他们获得了1989年的诺贝尔化学奖。毕晓普（Bishop）和瓦穆斯（Varmus）由于发现正常细胞同样带有原癌基因而分享了1989年的诺贝尔生理医学奖。1993年，美国科学家罗伯茨（Roberts）和夏普（Sharp）由于在断裂基因方面的工作而荣获诺贝尔生理医学奖。美国科学家马勒斯（Mullis）由于发明PCR仪而与第一个设计基因定点突变的Smith共享诺贝尔化学奖。1994年，美国科学家吉尔曼（Gilman）和罗德比尔（Rodbell）由于发现了G蛋白在细胞内信息传导中的作用而分享诺贝尔生理医学奖。我国生物科学家吴宪曾留学美国哈佛大学，回国后于1924—1942年担任私立北京协和医学院生物化学教授，兼生物化学系主任教授，他与汪猷、张昌颖等人一道完成了蛋白质变性理论、血液生化检测和免疫化学等一系列有重大影响的研究，成为我国生物化学界的先驱。在20世纪60—80年代，我国科学家相继实现了人工全合成有生物学活性的结晶牛胰岛素，解出了三方二锌猪胰岛素的结晶结构，采用有机合成与酶促相结合的方法完成了酵母丙氨酸转移核糖核酸的人工3全合成。另外在酶学研究、蛋白质结构及生物膜结构与功能等方面都有世所瞩目的建树。1.3分子生物学的研究内容如果从表面看，分子生物学涉猎范围极为广阔，研究的内容也似乎包罗万象，而事实上，它所研究的不外乎以下几个方面。1.3.1DNA重组技术（又称基因工程）DNA重组技术是20世纪70年代初兴起的的技术科学，目的是将不同的DNA片段（如某个基因或基因的一部分）按照人们的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。严格的说，DNA重组技术并不等于基因工程，因为它还包括其他使生物细胞基因组结构得到改造的体系。DNA重组技术是核酸化学、蛋白质化学、酶工程、遗传学、细胞学长期深入研究的结晶，而限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现与应用则是这一技术得以建立的关键。DNA重组技术有着广阔的应用前景。首先，它可被用于大量生产某些在正常细胞代谢中产量很低的多肽，如激素、抗生素、酶类及抗体等，提高产量，降低成本，使很多有价值的多肽类物质得到广泛应用。例如美国科学家最近发现的用于治疗艾滋病的基因工程白细胞介素12（IL-12），可有效地阻止病情发展，恢复HIV病毒携带者的免疫系统和功能；由转基因烟草产生的α-栝楼素也被用于抑制HIV的生长。其次，DNA重组技术可用于定向改造某些生物基因组结构，使它们所具备的特殊经济价值或功能得以成百上千倍地提高。例如有一种分解石油成分的重组DNA超级细菌，能快速分解石油，可用来恢复被石油污染的海域或土壤。美国科学家应用该技术构建了“工程沙门氏菌”，在研究避孕菌苗方面取得了重要进展。他们先取掉沙门氏菌致病基因部分，再引入来自精子的某些遗传信息，将改造后的细菌送入雌鼠体内，发现能产生排斥精细胞的抗体，使精子不能与卵子结合，从而达到避孕目的。预计这种新型避孕菌苗将在今后几年内投放市场。此外，设在波士顿的美国陆军研究发展和工程中心还从织网蜘蛛中分离出合成蜘蛛丝的基因，并利用这一基因在实验室里生产蜘蛛丝。他们将这一基因转移到细菌内，生产出一种可溶性丝蛋白，经浓缩后纺成一种强度超过钢的特殊纤维。研究人员希望对该基因进行修饰，以生产出高性能纤维，从而用于制造防弹背心、帽子、降落伞绳索和其他高强度的轻型装备。第三，DNA重组技术还被用来进行基础研究。如果说，分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制，那么根据中心法则，我们要研究的就是从DNA到RNA，再到蛋白质的全过程，也即基因的表达与调控。在这里，无论是对启动子的研究（包括调控元件或称顺式作用元件），还是对转录因子的克隆与分析，都离不开重组DNA技术的应用。1.3.2基因表达调控的研究因为蛋白质分子参与并控制了细胞的一切活动，而决定蛋白质结构和合成时序的信息都由核酸（主要是脱氧核糖核酸）分子编码，表现为特定的核苷酸序列，所以基因表达实质上就是遗传信息的转录和翻译。在个体生长发育过程中生物遗传信息的表达按一定的时序发生变化（时序调节）。并随着内外环境的变化而不断加以修正（环境调控）。基因表达的调控主要发生在转录水平和翻译水平上。原核生物的基因组和染色体结构都比真4核生物简单，转录和翻译在同一时间和空间内发生，基因表达的调控主要发生在转录水平。真核生物有细胞核结构，转录和翻译在时间和空间上都被分隔开，且在转录和翻译后都有复杂的的信息加工过程，其基因表达的调控可以发生在各种不同的水平上。基因表达调控研究主要表现在信号传导研究、转录因子研究及RNA剪辑三个方面。信号传导是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能方面的应答过程。当信号分子（配体）与相应的受体作用后，可以引发受体分子的构型变化，使之形成专一性的离子通道，也可以引发受体分子的蛋白激酶或磷酸酯酶活性，还可以通过受体分子指导合成cAMP、cGMP、肌醇三磷酸等第二信使分子。研究认为，信号传导之所以能引起细胞功能的改变，主要是由于信号最后活化了某些蛋白质分子，使之发生构型变化，从而直接作用于靶位点，打开或关闭某些基因。转录因子是一群能与基因5´端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间和空间表达的蛋白质分子。在对植物的某些性状进行遗传分析时发现，某些基因的突变会影响其他基因的表达。例如，有20多个基因参与玉米花青素的合成，但其中的Cl、r、pl或b基因发生突变后，该代谢途径中的结构酶基因全部关闭。如果Antp、Flz或Ubx等基因发生突变，果蝇的体节发育就会受到影响，身体中的一部分就会变成相似于另一部分的结构，因此它们是控制果蝇胚胎早期体节分化与身体发育的主要基因，它们所编码的蛋白质是调节与发育有关的结构基因的总开关。真核基因在结构上的不连续性是近十年来生物学上的重大发现之一，当基因转录成pre-mRNA后，除了在5‘端加帽和在3’端加多聚A[poly(A)]之外，还要将隔开各个编码区的内含子剪去，使外显子（编码区）相连后成为成熟mRNA。研究发现，有许多基因不是将它们的内含子全部剪去，而是在不同的细胞或不同的发育阶段有选择地