分子遗传学2.

第二章遗传物质的存在方式•真核细胞生物（高等动植物、真菌）:染色体结构形式存在,染色体由DNA和蛋白质组成,具有固定的结构、形态和数目。•原核细胞生物（细菌）：类核体（拟核体）形式存在，少量结合蛋白，无固定形态，实质为一条高度折叠、盘绕的双链DNA分子，原核细胞常含有类核体外的遗传物质——质粒。•非细胞生物（病毒）：以DNA或RNA分子形式存在，不结合蛋白，既有双链的DNA或单链的DNA分子，也有双链的RNA或单链的RNA分子。*真核和原核细胞中，DNA和RNA分子同时存在，完成不同的遗传功能；病毒体中仅有一种类型核酸存在，含DNA的称为DNA病毒，含有RNA的称为RNA病毒。2真核生物DNA以非常有序的形式存在于细胞核内。在细胞周期的大部分时间里，DNA以松散的染色质(chromatin)形式存在，在细胞分裂期，则形成高度致密的染色体(chromosome)第一节真核细胞的染色体结构•组成成分：DNA、蛋白质分子（组蛋白）少量RNA分子•基本组成单位：核小体（固定结构）•基本形态：条状、纺锤状、哑铃状等•主要结构：染色体臂、着丝粒、端粒等•基本功能：携带遗传信息，控制遗传性状染色体：在真核细胞分裂的中期，由染色质凝聚成的在显微镜下可观察到的棒状结构；染色质：一种纤维状结构，在细胞周期的大部分时间存在；常染色质：染色体大部分区域，染色质折叠压缩程度小，染色着色浅的区域；DNA包装比：约1000-2000异染色质：染色体局部区域，染色质在细胞间期折叠压缩程度大、致密，DNA包装比：约10000组蛋白(结构蛋白)+DNA（含大量重复序列）核小体(nucleosome)念珠状组装染色质+非组蛋白(+RNA)染色体DNA:约27%组蛋白和非组蛋白:约66%RNA:约6%5DNA染色质呈现出的串珠样结构。染色质的基本单位是核小体(nucleosome)。DNA染色质的电镜图像一、核小体（nucleosome）的组成结构八聚体：(H2A、H2B、H3、H4)2(核心组蛋白)染色质小体coreDNA：146bp，盘绕八聚体13/4圈（165bpDNA，核小体螺旋盘绕２圈）H1组蛋白：八聚体入口与出口间，盘绕19bpDNA间隔DNA（linkDNA）：连接在染色质小体之间，35bpDNA核小体的组成结构组蛋白一组进化上非常保守的碱性蛋白质，其中碱性氨基酸(精氨酸Arg，赖氨酸Lys)约占25%；真核生物组蛋白，分为5种类型(H1，H2A，H2B，H3，H4)，后4种各2个形成组蛋白八聚体，构成核小体的核心，占核小体质量的一半。组蛋白类型碱性氨基酸氨基酸数分子量（Da）LysArgH129%1%21523,000H2A11%9%12913,960H2B16%6%12513,775H310%13%13515,340H411%14%10211,280小牛胸腺DNA的组蛋白9核小体核心颗粒核小体连接区5.5nm11nmH1H3H2BH4H2ADNA双链核小体串珠样的结构10H2A、H2B、H3和H4各2个形成八聚体组蛋白和DNA形成核小体11第一层次折叠第二层次折叠第三层次折叠30nm双链DNA核小体构成截面图染色质纤维空管双链DNA的折叠和组装12第三层次折叠染色质纤维1.4m核基质第四层次折叠截面图300nm形成染色体DNA经过多次折叠，被压缩了8000～10000倍，组装在直径只有为数微米的细胞核内。二、染色体的高级结构10nm的核丝（nucleofilament）——一级结构30nm螺旋管（solenoid）——二级结构•放射环模型（radealloopmodel）•螺旋环模（MarsdenLaemmli,1979,Paulson.,1982）•放射环和螺旋环共存模型（Rattner和Lin，1985）•袢环模型（J.Painta和D.Coffey,1984）•螺旋折叠（helicallyfolded）(BoydeTour,Ey和LaemmliU.K.1988)等模型侧环模型——三级结构染色单体——四级结构相邻2个核小体间，有长约50～60个碱基对的DNA连接线，其结合着一个第5种组蛋白（H1）的分子。密集成串的核小体形成了核质中的100埃左右的纤维，这就是染色体的“一级结构”。在这里，DNA分子大约被压缩了7倍。染色体的高级结构•10nm的核丝（nucleofilament）染色体的一级结构经螺旋化形成中空的线状体，称为螺线体或核丝，这是染色体的“二级结构”，其外径约300埃，内径100埃，相邻螺旋间距为110埃。螺线体的每一周螺旋包括6个核小体，因此DNA的长度在这个等级上又被再压缩了6倍。•30nm螺旋管（solenoid）核丝怎样形成更高级的结构呢？1976年Finch和Klug提出的螺旋管（solenoid）模型。10nm的染色质纤丝螺旋缠绕成直径为30nm的螺旋管，内径为10nm，螺旋11nm，螺旋的每一周由6个核小体组成。30nm螺旋管如何进一步压缩30nm的纤丝，Lacmmli等（1977，1979）对细胞中期染色体，除去组蛋白和大部分非组蛋白，在电镜下观察到由非组蛋白构成的染色体骨架（scaffold）和由骨架伸出的30nm纤丝状DNA环状区域（loopeddomain），提出非组蛋白的骨架学说。在骨架模型的基础上人们又先后提出了放射环模型和螺旋环模型（Marsden和Laemmli,1979,Paulson,1982）、放射环和螺旋环共存模型（Rattner和Lin,1985）、袢环模型（J.Painta和D.Coffey,1984）、螺旋折叠(BoydeTour,Ey和LaemmliU.K.1988)等模型，•侧环模型：现在一般认为,30nm的纤丝和非组蛋白骨架结合形成很多侧环，每个侧环长10-90Kb，约0.5m，人类染色体约2000个环区。而每个环，与染色体的复制单位，以及表达调控有关。带有侧环的非组蛋白骨架进一步的形成直径为700nm的螺旋，这就是染色单体，而由两条姐妹染色单体形成的中期染色体直径为1400nm，螺旋的方向是相对的。从染色体的一级结构到四级结构，DNA分子一共被压缩了8400倍。30nm螺旋管电镜形态22真核生物的染色体三、着丝粒和端粒（一）着丝粒(centromere)：染色体上一个相对不着色的缢缩部位，是细胞分裂时染色体上纺锤丝微管的附着点。•对酿酒酵母的着丝粒DNA序列研究结果表明：由三个功能区组成•中部的元件(II)由80~90bp组成，A+T含量高，90%；•左侧的元件(I)含有PuTCACPuTG顺序（Pu是嘌呤），•右侧的元件(III)是由26bp组成的保守区，此区也是A-T丰富区。•所有真核生物的着丝粒功能都相同，但其DNA却具有种的特异性。•着丝粒、端粒的位置酵母着丝粒人类着丝粒(二)端粒（telomere）端粒：是染色体上增大的末端染色粒，是一特定的DNA-蛋白质复合体结构，是染色体的组成部分。能封闭正常染色体末端，防止连接；使染色体具有极性（polarity），从而保证染色体在细胞分裂期的正常行为；特殊情况下，具有着丝粒的活性；由无规则折叠的染色丝和蛋白质组成。•染色体端粒显微镜图•1938年，著名的遗传学家B.Mcclintock和HJ.Müller发现：染色体的末端可维持染色体的稳定性•Müller将它定义为“telomere”，这是由希腊语“末端”（telos）及“部分”（meros）组成的•染色体失去了这些片段，就会互相粘连到一块，发生结构及功能上的改变，从而影响到细胞的分裂与生长端粒的发现•1978年，E.H.Blackburn等研究四膜虫rDNA时，揭示了端粒DNA的初步结构：–由非常短且数目精确的串联重复DNA片段组成，富含嘌呤G。–结构：一条链Gn（T/A)m，互补链Cn（A/T)m。n﹥1，m为1～4。(四膜虫为5’–G4T2-3’)–重复次数由几十到数千不等(四膜虫长度为370-520bp，重复几十次)端粒DNA结构端粒的共同特点（要求）•每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。Cn(A/T)m，其中n1，而m=1~4。•在端粒区域中有一种特殊的不连续排列，产生单链断裂的形式，这种结构并不能被连接酶将缺口封闭起来，而在正常情况下连接酶是可以作用DNA链上的缺刻（nick）。•提纯的天然的端粒区可直接用E.ColiDNA多聚酶I进行缺口平移(nicktranslation)。•在端粒区的最末端可能带有3`-OH的单链末端回折成了发夹回(hairpin)结构。•端粒的双链部分中含有T2G4的顺序在3`末端，排列方向是朝向染色体的中心部位。几种生物端粒的重复单位生物物种DNA来源重复单位（5'－3'）四膜虫Tetrahymena,Paramecium大核CCCCAA尖毛虫StylonchiaOxytricha,Euplotes大核CCCCAAAA鞭毛虫Trypanosoma,Leishmania微染色体CCCTA酵母Saccharomyces染色体C2-3A(CA)1-3拟南芥Arabidopsis染色体C3TA3泥毛霉菌Phyparum,DictyosteliumrDNACCCTA人HomoSapiens染色体C3TA2人类端粒DNA的四连体结构端粒的功能（要求）•保持染色体的稳定•使线形DNA的顺利复制•影响染色体的行为•可能控制细胞的寿命•和核骨架的组成有关2、端粒酶(telomerase)•是端粒复制所必须的一种特殊的DNA聚合酶。•具有逆转录酶活性。•能以hTR为模板，向染色体末端添加TTGGGG序列。•端粒酶的发现：•1984年J.W.Szostakand和E.H.Blackburn等在研究四膜虫的端粒在酵母中的复制过程（即著名的加尾实验），发现模板不在端粒上；•1985年C.W.Greider和Blackburn进行了体外加尾实验，验证了端粒酶的存在；并在1987年分离纯化了端粒酶，进一步分析发现其是含有RNA的反转录酶。端粒酶组成•端粒酶RNA(humantelomeraseRNA,hTR)•端粒酶协同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)•端粒酶逆转录酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)端粒酶RNA的一级结构缺乏保守性，但都有保守的二级结构。端粒酶的结构●modelTBPisReversetranscriptase-likeRNAcomplementwith3’endofDNA&astemplateforcDNAElongatedT2G43’-endasprimerfor5’-endDNAsynthesisG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGGC链--A2C4----telomerase3’aaaAACCCCAACuuac---5’TTG端粒酶与染色体DNA末端的3’单链区域结合（5’短缩），端粒酶中的RNA与DNA配对结合telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’G链–T2G4-----TTGGGGTTGGGC链--A2C4----TTGtelomerase3’aaaAACCCCAACuuac---5’GGGTTGG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGC链--A2C4----TTGGGGTTG-------------telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’telomerase3’aaaAACCCCAACuuac---5’端粒酶中的RNA与DNA配对结合并以CCCCTT序列为模板，以DNA3’OH端为