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第四章DNA的复制复制（replication）：是指以原来的DNA分子作为模板合成出相同分子的过程。复制在保持生物稳定性方面起重要作用；复制是细胞分裂的前提和基础；复制是精确的复制，一般不会差错；复制方式为半保留复制（semiconservativereplication）。第一节半保留复制的验证半保留复制：新合成的每个子代DNA分子中，一条链来自亲代DNA分子，另一条链是新合的，这种复制方式被称为半保留复制。半保留模型（semioconservetivemodel）全保留复制模型(conservetivemodel)分散模型(Dispersivemodel)半保留复全保留复分散模型制模型制模型15N15N15N15N15N15N第一次复制14N15N15N14N15N15N14N14N14N14N15N15N15N15N14N14N第二次复制图11-1三种不同的复制模型验证半保留复制的实验Meselson-Stahl实验Taylar实验姐妹染色单体差别染色方法Cairns复制模型—θ型复制15N15N14N14N/15N15NDNA浓度14N14N/15N15N离心第14N一14N15N14N15N次离心实验14N15N14N14N14N14N14N15N离心第离心二次实验14N15N离心密度(a)(b)(c)图11-2Meselson-Stahl实验(a)实验结果的解释(b)SsCl梯度离心的结果；(c)离心后DNA的吸受率下图为Taylor蚕豆根尖放射自显影实验：（a）按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；（b）实验结果染色体放射自显影的图示。(a)2H3H2H2H(b)2H3H2H2HT/T第一周期M1T/BUdRBUdR/T第二周期M2BUdR第三周期M3第四周期M4图11-5姊妹染色单体差别染色的原理和结果3H+CED1.5代BA放射自显影图11-7Cairns实验原理及过程第二节复制的起点、方向和终点一.研究方法：1.用同位素标记电镜观察及变性法2.用噬菌体插入标记法同步培养不同步培养3.变性定性法4.双向电泳法Orit/Orit(a)(b)图11－8(a)若有固定起始点，双向负制，则复制终点应在起点的对面。(b)若有固定起始点,单向复制，则复制终点应和起点重叠。图例：未标记，轻标记，重标记图11-10用同位素标记复制叉来确定是单向复制还是双向复制二、原核的复制起点和方向复制起点（origin,ori）：DAN分子上特定的发动复制的起始位点。复制终点（terminus）：DNA分子上复制终止的位点。复制子（replicon）：从复制起点到复制终点这样一个完整的DAN单位称为复制子。原核细胞基因组实质为一条双链DNA分子，作为一个复制子，整个基因组的复制起始于单一位点（起点）；真核细胞基因组庞大，有多个复制起点和复制终点，含有多个复制子。复制特点：E.coli定点、双向对称复制;枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制;质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组时进行双向复制;质粒ColE1有固定起始点，但却为单向复制;mtDNA进行D（displacedloop）环复制。OriOriOri(a)枯草杆菌(b)R6K质粒(c)ColE1图11-14原核生物中特殊的复制类型D环复制第三节原核生物复制的酶系统考察基因功能的常用方法------突变体的表型变化考察复制有关酶的常用方法------温度敏感突变体利用大肠杆菌温度敏感突变体------复制有关基因(dna)快停突变体：温度升高，复制立即停止。缺失复制体组分的酶，特别是延伸的酶或参与供应关键前体的酶。dna突变体慢停突变体：在非允许温度下，可以完成当前的复制，但不能开始新的复制。缺失复制起始有关的酶。一、DNA聚合酶(DNApolymerase)DNA聚合酶的共同特点：需要提供合成模板；不能起始新的DNA链；必须要有引物提供3'→OH；合成的方向都是5'→3'；除聚合DNA外还有其它功能。E.coli中的三种DNA多聚酶DNApolⅠDNApolⅡDNApolⅢ结构分子量109KD90KD900KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞400？10-20酶活性：5→3`聚合酶+++3`→5`外切酶+++5`→3`外切酶+－－(可切单链)突变体突变位点polApolBpolC(dnaE),dnaN,dnaZX,dnaQ,dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制（一）DNA聚合酶I的结构DNA聚合酶有6个结合位点；模板结合位点；引物结合位点；引物3'－OH结合位点；底物dNTP结合位点；5'→3'外切酶结合位点；3'→5'校正位点。聚合3'－5'外切5'－3'外切3'5'dNTPNMP5'3'图11-19DNA聚合酶Ⅰ的结构和功能（二）DNA聚合酶Ⅰ的功能1.5’→3’聚合功能；2.3’→5’外切活性；3.5’→3’外切活性；(1)切口平移（nicktranslation）；(2)链的置换；(3)模板转换（template-switching）；4.内切酶活性。5'3'GTAAGTCG·····CTCAGC5'3'3'－5'外切核酸酶水解部位图11-20DNA聚合酶Ⅰ的3'－5'外切酶活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-16)3'5'GGACAAGA·····GACGTTCT5'3'内切酸酶水解部位图11-22DNA聚合酶Ⅰ的内切酸活性(仿D.Freifelder:《MOLECULARBIOLOGY》1983,Fig.8-20)5'3'-OH5'-P3'5'3'3'5'缺口平移链的置换模板转换5'3'5'5'3'5'3'3'5'3'5'3'5'(a)(b)(c)图12-21DNA聚合酶Ⅰ5'－3'外切活性的功能（三）DNA多聚酶Ⅲ的结构PolⅢ*核心酶α：130K(polC即dnaE)—DNA合成(470K)(165K)ε：25K(dnaθ)—3'－5'外切酶活性,校对2核心＋2τ合成DNAθ：10K—使核心酶相互连接。PolⅢ'增加进行性(750K)τ：71K(dnaZX)—使核心酶形成二聚体，与模板连接。具有全酶使γδ复ATP活性。合成前合体结合导链和模板δ：32KEFⅢ,催化β亚基转移到模板链上。EFⅡ后滞链γδ复合体γ：52K(dnaZX)催化β亚基转移到模板链上。(附加亚基)δ'：35Kχ：15Kψ：12Kβ：40K(dnaN)—识别模板链，将酶“夹”到DNA链上。图11-23DNA聚合酶Ⅲ的成分与功能全酶在DNA上的装配分为三个阶段一个β二聚体加上一个γ复合体识别引物模板形成一种前起始复合物；DNA在于β,γ复合体结合的位点构象发生改变，而对核心酶产生了高亲和力使核心酶能与DNA结合；τ二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。二、DNA连接酶（DNAligase）作用是连接DNA分子，封闭缺口。分三步进行：1.E＋ATP→E－AMP＋ppi在E.coli中：E＋NAD→E－AMP＋NMN2.E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化；3.活化的5’－PO4与相邻的3’－OH作用形成3’－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。三、螺旋酶（helicase）又称解旋酶，是促进DNA的两条互补链分离的酶。是DNA复制、重组、修复过程中关键的发动蛋白；具有依赖DNA的ATPase活性，利用ATP水解产生的能量解旋DNA并使螺旋酶沿DNA链移动。与产物单链DNA结合，如螺旋酶Ⅰ，螺旋酶Ⅱ。螺旋酶仅仅催化DNA双链的分离，常与SSB蛋白结合如E.coli中rep蛋白，螺旋酶Ⅲ。表11-3E.coli及噬菌体的解旋酶解旋酶结构功能DnaB330K六聚体结合与OriC,Oriλ参与前引发分离双链，水解ATP,提供能量。rep蛋白66K单体ATP依赖性解旋酶，在φX174滚环复制中推进复制叉PriA(w蛋白)82K单体φX174Rf形成中参与前引发体3’→5′移动取代SSB，识别特异位点。TraY/I多聚体F因子滚环复制中解链。基因4蛋白58KT7噬菌体复制中延5’→3′解链。四、拓扑异构酶（topoisomerase）拓扑异构酶：催化DNA环的拓扑异构体之间转化的酶，它可以催化一个DNA分子单链或双螺旋链穿过另一个单（双）链。Ⅰ型拓扑异构酶：催化DNA链断裂和重新连接，每次只作用一条链，即催化瞬时的单链断裂与连接，一般不需要能量，如大肠杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ。拓扑异构酶Ⅱ型拓扑异构酶：能同时断裂并连接双股DNA链，它们通常需要能量（ATP），如大肠杆菌的DNA旋转酶（gyrase），又称DNA拓扑异构酶Ⅱ。五、单链结合蛋白（singlebindingprotein，SSB）单链结合蛋白：又称双螺旋去稳定蛋白(helixdestabilizingprotein)，可以结合单链ＤＮＡ，防止形成双链，同时保护单链ＤＮＡ不被核酸酶水解。由177个aa组成;在E.coli中以四聚体存在;分子量为74KDa;在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应：（1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。第四节原核生物和病毒的复制原核细胞染色体DNA的复制起始于固定位点，双向复制；噬菌体、病毒核酸的复制可以起始于不同位点，双向或单向复制，也可以采取特殊的复制方式，如滚环复制。大肠杆菌--------------环状DNA分子F质粒(F因子)----------环状DNA分子噬菌体----------------环状DNA分子腺病毒----------------线状DNA分子一、大肠杆菌环状DNA复制(一)复制的起始E.coli复制起始区的结构特点:富含A－T，这可能和双链易于解开起始复制有关；含有多个回文结构（9－14个GATC），8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：①转录产生引物；②产生复制必要的蛋白；③产生调节功能的RNA；④起转录激活作用。GATCTNTTNTTTTCTGGATAATTtGGATAAR1R3LMR123423628088186194231239260268R2R4AATAtGTGAAATAGGTGT13－聚体9－聚体245bp图11-27E.coli复制起点OriC的结构转录的起始发动过程（E.coli）起始复合物的形成预引发体的形成RFⅠ(replicatingformⅠ)的形成引发体的形成DNA的合成表11-4在OriC上前引发所需的六种蛋白蛋白功能对蛋白质的要求DnaA(S)协同结合于9bp和13bp重复顺序20-40单体DnaB(F,S)结合于DnaA，提供解旋酶活性1-2六聚体DnaC(F,S)和DnaB形成复合体六个单体HU组蛋白样蛋白，激发复合体形成～5个双体Gyrase旋转酶，解除正超螺旋，引入负超螺旋催化ssB(F)稳定单链化学剂量，四聚体(S):慢停突变；（F）：快停突变复制起点具有3个13bp和4个9bp的重复顺序GATCTNTTNTTTTTTATNCANADnaA单体结合在9bp的重复顺序上13bp9bp20～40个DnaA单体形成一个大的复合物在13bp重复顺序上DNA解链DnaB/DnaC结合成复合体，产生了复制叉DnaBDnaBDnaC图11-28前引发涉及到系列蛋白的连续装配并导致DNA的解链(引自B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997，Fig15.18)（二）、复制的延伸半不连续复制：在DNA的双向复制中，其中先导链是沿着复制叉进行延伸，为连续复制，后滞链是逆复制叉方向进行不连续复制，每次合成的DNA为一个岗崎片段，DNA的这种复制方式称为半不连续复制。DNA的复制方向为5′-3′；岗崎片段的大小约为1000nt，每个岗崎片段的合成都包括新一轮的起始发动的过程；岗崎片段间的缺口由DNA聚合酶Ⅰ催化填充；DN