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Protocal1.G418的配制：取1gG418溶于1ml1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。4.加G418筛选:吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4。6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200ug/ml。这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。a转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。c换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10～14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；d挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。e单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。常见问题：1.转进去的重组质粒以什么形式存在于细胞内的？无怪乎两种形式：整合在染色体中和存在于细胞质中。没有经过筛选前大部分转染进细胞的质粒是存在于胞质中的，但是这种质粒是不稳定的，基本上筛选不出这种单克隆，只有稳定整合入染色体的才是我们想要的稳定细胞系。2.neo基因和目的基因是不是一定会整合在一起？整合是随机发生的非同源性重组，neo基因表达而目的基因不一定都表达，所以在筛选之后还要用RT-PCR的方法进一步鉴定。培养基处理的个人技巧体内的任何细胞被置于体外培养后，对环境都有一个适应过程，期间细胞对培养液具有同化作用，即细胞从培养液中摄取营养的同时，也向培养液排出自己的代谢产物和其它一些物质，其中有排泄物也有促细胞生长因子。这个过程也是细胞同化培养基的过程。细胞越多则其同化作用越强，所以细胞数目多比数目少较易生长。在筛选后期，大批细胞死亡，不换液没有死亡的细胞就会受到死亡细胞的影响，换液后残留的少量细胞对培养基的同化作用不强，也不利于生长。我是用适应性培养基来解决这一问题的：适应性培养基的配制a培养同源细胞至半汇合状态时，更换一次培养液，再继续培养24～48小时后，吸出所有培养液b离心：3000～4000rpm10min后，吸取上清液c虑过：再经直径0.22um滤器过滤，再加入2倍体积的新鲜培养基，低温冻存备用。eeflying1.G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell/mL，每孔100uL加入有培养基的24孔板，将每孔中的G418浓度稀释至0，100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1100ng/mL等12个级别。培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准，一般400-800左右，筛选时比该浓度再高一个级别，维持使用筛选浓度的一半。２.我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用，因为有时候抗性基因会丢失，如果没有G418，很快会形成优势的。３.即是有G418抗性，也不一定有目的基因，单克隆化操作是很重要的。转染后，每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的，目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快，在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后，表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要，转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。所以，要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞，遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。操作用96孔板法，每代细胞长满后，大多数冻存，留200cell左右就可以进行该操作了，该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代培养书中均有讲述。1.可以肯定的是，外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的，这点我们做过FISH验证过，表达量与整合数目，上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了SV40只是增加了表达了数目，但并不能掩盖其它因素对表达的影响。按你的讲法，转染完GFP的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同，不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。有时，neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。2.那为什么还要筛选基因？是这样，用概率论的思维来理解，某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性，及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。打个比方，一个大口袋，抓100个红球，再抓100个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢？应该是很小的。红球就是neo，黄球就是你的目的基因。我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢？用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球，另一次抓着10个红球，可以肯定，第二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。因为二者出现的概率比是恒定的。3.维持就是只要养这种细胞，就要维持。可以再低些，但不能没有。或者隔一定时间从新使用筛选量压一下，我不知你是否干临床，想想抗生素的用药原则，反向思维一下，实际上我们在筛选耐药株呀。4.neo的产物是酶，过高的G418浓度就要有更多的neo酶来支持，否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过，即使在同一转染阳性细胞，在不同浓度的G418液中生长速度也不同，严重形态也不同。这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的，用米氏方程理解吧。5.胰酶的作用不必理会，有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验，而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。在第10天左右就手挑单克隆或者96孔板单克隆操作了本帖开始我就讲了如何确定基准浓度，筛选浓度是基准浓度的高一级，维持用筛选浓度的一半。