16SrDNA-实验原理

1一、实验原理随着分子生物学的迅速发展，细菌的分类鉴定从传统的表型、生理生化分类进入到各种基因型分类水平，如(G+C)mol%、DNA杂交、rDNA指纹图、质粒图谱和16SrDNA序列分析等。细菌中包括有三种核糖体RNA，分别为5SrRNA、16SrRNA、23SrRNA，rRNA基因由保守区和可变区组成。16SrRNA对应于基因组DNA上的一段基因序列称为16SrDNA。5SrRNA虽易分析，但核苷酸太少，仅几十bp，没有足够的遗传信息用于分类研究；23SrRNA含有的核苷酸数几乎是16SrRNA的两倍，分子量太大，分析较困难。而16SrRNA相对分子量在2kb左右，较为适合PCR扩增，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16SrRNA作为序列分析对象对微生物进行测序分析。16SrRNA的编码基因是16SrDNA，但是要直接将16SrRNA提取出来很困难，因为易被广泛存在的RNase降解，因而利用16SrDNA鉴定细菌，其技术路线如下：DNA提取PCR扩增PCR实验原理细胞培养液基因组DNA16SrDNA片段片段回收测序阳性克隆鉴定连接克隆载体2即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。二、主要器具及试剂PCR、电泳系统、DNA提取体系、TaqPolymerase、DNAMarker，溶菌酶、dNTP和E.coliJM109感受态细胞、pMD18-TVector、琼脂糖、SDS裂解缓冲液、50×TAE电泳缓冲液贮存液、1×TE（pH8.0）三、操作方法1.细菌基因组总DNA的提取接种纯化的菌株于LB液体培养基中，180r/min，37℃培养过夜，按以下的方法提取细菌基因组总DNA。(1)菌体收集：取1.5mL新鲜的菌液于EP管中，12000r/min离心30s，弃净上清，收集菌体。(2)辅助裂解：加100μg/mL溶菌酶50μL，37℃处理30min。(3)裂解：向每管加入200mL预冷的SDS裂解缓冲液，用吸管头迅速强烈抽吸以悬浮和裂解细菌细胞。(4)向每管加入66μL5mol/LNaCl，充分混匀后，12000r/min离心10min，除去蛋白质复合物及细胞壁等残渣。(5)将上清转移到新EP管中，加入等体积的Tris-饱和酚，充分混匀，12000r/min离心3min，进一步沉淀蛋白质。(6)取离心后的水层，加等体积的氯仿/异戊醇（体积比24：1），充分混匀后，12000r/min离心3min，去除苯酚。(7)小心取上清，用预冷2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，13000r/min离心15min，弃上清。(8)用400μL75%的乙醇洗涤沉淀2次。(9)室温干燥后，用40μL1×TE溶解DNA。(10)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA。(11)提取的基因组总DNA-40℃冰箱保存备用。32.PCR扩增细菌的16SrDNA(1)16SrDNA的PCR引物：采用细菌的通用引物27F和1492R(2)PCR反应体系为（20μL）：灭菌蒸馏水8.9μL，10×buffer2μL，10mmol/LdNTP0.4μL，27F和1492R引物各4μL，DNA模板0.5μL，Taqpolymerase0.2μL。(3)PCR反应条件：93℃预变性5min、94℃变性18s、56℃退火15s、72℃延伸78s，循环30次，72℃延伸7min。(4)1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。3.PCR扩增目的片断的纯化通过PCR扩增出大量的目的片段，经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯下切下含有目的条带的胶块装入1.5mL的EP管中，用B型小量DNA片段快速胶回收试剂盒回收DNA，操作按说明书进行，方法如下：(1)加入700μL溶胶液，55℃水浴溶胶，其间偶尔摇动，直至胶块全部溶解。(2)将溶胶液转移至吸附柱中，12000r/min离心30s，重复一次，提高回收率。(3)向吸附柱中加入500μL漂洗液，12000r/min离心30s，倒掉废液，重复漂洗一次。12000r/min离心2min以完全去除漂洗液。(4)将吸附柱移至一个干净的1.5mLEP管中，向吸附柱膜中央加入40μL的洗脱缓冲液，12000r/min离心2min收集DNA。(5)回收DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。4.16SrDNA目的片断的克隆PCR纯化产物与pMD18-T载体连接体系（10μL）：胶回收产物2μL，pMD18-T载体1μL，SoulutionⅠ5μL，无菌去离子水2μL，16℃连接4h。转化E.coliJM109(1)取50μLE.coliJM109感受态细胞于冰中融化。4(2)将5μL连接产物加入到已融化的感受态细胞中，轻轻吸打混匀，冰浴30min。(3)42℃保温90s。(4)冰浴2~3min。(5)加入450μLLB液体培养基，轻轻混匀，200r/min，37℃培养40min。(6)取适量上述培养液均匀涂布在Amp/X-Gal/IPTG的LB平板上，37℃培养过夜。5.转化子的筛选和鉴定（1）重组菌株的菌落PCR通过蓝白斑筛选阳性转化子，用灭菌的枪头将白色菌落接种至4mLLB液体培养基中，200r/min，37℃培养4h。取菌液作为PCR模板。PCR反应体系（20μL）：灭菌蒸馏水7.4μL，10×PCRbuffer（含15mmol/LMgCl2）2μL，10mmol/LdNTP0.4μL，2.5μmol/L的上游和下游引物各4μL，菌液2μL，5U/μLTaqpolymerase0.2μL。PCR反应条件：93℃预变性5min、94℃变性18s、56℃退火15s、72℃延伸78s，循环30次，72℃延伸7min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。（2）重组质粒的核苷酸序列的测定对经过鉴定含有目的片断的单克隆菌液加入甘油-40℃保存，同时将同一单克隆菌液送上海生工生物工程有限公司进行序列测定，将测得的序列提交GenBank数据库，根据测序结果，用BLAST搜索软件在NCBI（）的GenBank数据库中调出相似性较高的16SrDNA基因序列，用ClustalX1.81软件进行多序列比对，用Phylipwx软件包中的Seqboot，Dnapars和Consense进行同源性分析并构建系统发育树。四、实验结果提交鉴定菌株的序列与哪个种最匹配，并构建该菌株的系统进化树。