分子标记技术在西瓜遗传育种上的应用研究进展

分子标记技术在西瓜遗传育种上的应用研究进展摘要西瓜是世界上重要的水果之一。分子标记技术在西瓜研究中的应用，给西瓜的遗传育种工作带来了极大的便利。目前，分子标记已成功应用于西瓜亲缘关系和遗传多样性分析、图谱构建、重要性状基因的连锁标记和杂种纯度鉴定等诸多领域。本文从种质资源遗传多态性与亲缘关系、遗传图谱的构建、目标性状的连锁分子标记与分子标记辅助育种、品种及杂交种纯度鉴定等方面展开综述，探讨近年来分子标记技术在西瓜遗传育种上的应用研究进展。关键词分子标记，西瓜，遗传多样性，遗传图谱ApplicationsofMolecularMarkeronWatermelonGeneticsandBreedingProgramsAbstractWatermelonisoneoftheimportantfruitsintheworld.Itwouldbebecominggreatconveniencesforwatermelonbreedingprograminvirtueofmolecularapproaches.Sofar,DNAMarkertechniqueswouldbewidelyusedintheareaofspeciesrelationships,geneticdiversities,linkagemapconstruction,importanttraitgenotypingandlinkedgenemapping,molecularmarkerassistedbreeding,andcultivarpurityindentificationandsoon.Inthispaper,wereviewedtheresearchprogressesofwatermeloninthegenticsandbreedingprogram,inparticularmentionedabove.Keywordsmolecularmarkers,watermelon,geneticdiversities,geneticlinkagemaps引言分子标记是以生物大分子的多态性为基础的遗传标记，分子标记技术的出现使作物育种的间接选择成为可能，提高了遗传分析的准确性和选育的有效性，对科学、快速地鉴定种质、检测种子的纯度和真实性、保护新品种的知识产权等具有重要意义。广义的分子标记指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质，蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶及等位酶；狭义的分子标记概念只是指DNA标记，这个界定现在被广泛采纳(周延庆，2005)。分子标记技术根据其核心技术可将其分为三大类：第一类是以分子杂交(Southern杂交)为核心的标记技术，包括RFLP标记、DNA指纹技术、染色体原位杂交等；第二类是以聚合酶链式反应PCR技术为核心的标记技术，包括RAPD标记、SSR、ISSR、AFLP、STS、SCARs、AP-PCR、SRAP标记等；第三类是一些新型的分子标记，如SNP标记、EST等。分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的新的一种遗传标记，反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，直接反映了基因组DNA间的差异，有许多明显的优越性(周延庆，2005)，表现为：(1)直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；(2)数量极多，遍布整个基因组；(3)多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；(4)表现中性，不影响目标性状的表达；(5)许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。西瓜是世界上重要的水果之一。长期的育种实践表明，西瓜种质资源间的遗传多态性很低。分子标记技术在西瓜研究中的应用，无疑给西瓜的遗传育种工作带来了极大的便利。目前，已成功应用于西瓜亲缘关系和遗传多样性分析、图谱构建、重要性状基因的连锁标记和杂种纯度鉴定等诸多领域：(1)国内外许多学者进行了西瓜遗传多样性的分析研究，结果发现西瓜具有较低的遗传多样性；(2)构建了数张西瓜的遗传连锁图谱，并将重要性状连锁基因进行了定位；(3)对我国部分西瓜栽培品种进行了品种鉴定与纯度检测的研究。1种质资源遗传多态性与亲缘关系分子标记所检测的是植物基因组DNA水平的差异，因而非常稳定，在分子图谱帮助下对品种之间的比较，大大提高了结果的可靠性。分子标记一方面可用于品种资源的鉴定与保存，研究作物的起源与发展进化，确定亲本之间的遗传差异和亲缘关系，从而确定亲本间遗传距离，指导杂交育种亲本选配，减少杂交组合数，有效划分杂种优势群，为提高育种效率提供依据；另外，通过亲缘关系分析，可以纠正形态分类中一些不恰当的结论以及目前育种工作中存在的一些问题。西瓜栽培品种与其近缘野生种遗传资源比较丰富，种植资源遗传多态性的研究以及物种亲缘关系的鉴定、评价是对其进行有效利用的关键。迄今，国内外许多学者进行了西瓜遗传多样性的分析研究。早期学者进行西瓜遗传多样性的同工酶与贮藏蛋白分析，但检测到的多态性极低。Navot等(1996)曾用同工酶与蛋白质来研究西瓜的遗传多样性与遗传关系方面发现在384份西瓜材料中，其中26个酶位点中只有4个具有多态性；在西瓜栽培种(Citrulluslanatus)与西瓜野生种(Citrulluscolocynthis)之间存在着丰富的同工酶与种子蛋白的多态性，首次确定西瓜中19种蛋白编码基因之间的连锁关系。Biles等(1989)分析了8个商业品种的11个蛋白位点，在子叶、茎与叶组织上无差异，只在伤流液中发现蛋白谱带上有差异，并可能与抗枯萎病有关，这也是仅有的一篇在栽培品种间确有蛋白谱带差异的报道。ZhangX.P.等(1993)选用53个引物对西瓜的3个栽培品种与1份栽培种(Citrulluslanatus)的野生类型材料以及1份栽培种与野生种的杂交后代进行的RAPD检测结果表明在全部5份材料中，多态性为62.3%，而在3个栽培品种内，多态性仅为10.1%，其平均遗传距离为0.240～0.263。李严等(2005)用SRAP标记进行西瓜杂交种遗传多态性的研究,利用25个引物组合对生产上推广的20个西瓜杂交种进行扩增，从中筛选得到20个多态性引物组合，共产生135个多态性条带，平均每个引物组合产生7.11个多态性条带，显示了较高的多态性比率。赵虎基等(1999)用RAM标记对籽用西瓜的12个品种(系)和西瓜种内其他变种的4个品种(系)进行了遗传多样性的检侧，结果表明始选出的14个随机引物均能扩增出多态性片段，反应了不同品种(系)的遗传差异，并计算了这12个西瓜品种(系)的Nei'相似系数，建立了UPGMA系统树，得出它们之间的亲缘关系。LeeSL等(1996)对39份西瓜材料进行RAPD检测与聚类分析，其平均遗传距离的变动范围为0～0.366。Jarret等(1997)用SSR标记对西瓜种质的亲缘关系进行了研究，证明栽培品种间也有较多的差异。Hashizume等(1993)通过RAPD分析发现，在西瓜(Citrulluslanatus)的杂交种Fijihikari的双亲间能产生多态性的引物仅为3%。郭军等(2002)用RAPD标记对国内外32份西瓜主栽品种与其骨干亲本及野生类型的遗传亲缘关系进行研究，从720个随机引物中筛选出15个能产生稳定多态性的引物用于RAPD反应，实验结果不仅从分子水平验证了西瓜是遗传基础狭窄的作用，而且在分子水平对西瓜传统分类与地理生态型分类进行了分析。刘文革等(2004)对西瓜二倍体及同源多倍体的遗传差异进行AFLP分析，结果表明大部分引物组合扩增出的不同倍性西瓜之间的AFLP谱带无明显差异，表明不同倍性西瓜间的多态性很低。李晓慧等(2007)用SRAP标记对不同倍性西瓜的多态性进行分析，结果表明不同倍性西瓜之间SRAP多态性较低。段会军等(2007)用AFLP标记对48个西瓜品种进行多态性分析，结果表明西瓜品种间同源性较高、遗传基础狭窄，多数品种亲缘关系较近。段会军等(2006)用RAMS标记对河北省不同地区的3个西瓜枯萎病病株分离物Fon1、Fon2、Fon3各10个单孢菌株进行了基因组多态性分析，结果表明同一病株分离物的不同单孢菌株之间在分子水平上存在遗传差异性。刘立功等(2004)用RAPD标记对国内外26份西瓜材料进行遗传亲缘关系研究，结果将供试26份材料分为6个类群：1个美国生态型类群、2个中间生态型类群、1个东亚生态型类群、2个野生类群，并将京欣一号杂种纯度鉴定的RAPD特异标记K14-1500与N04-600成功转化为SCAR标记，同时应用于京欣一号纯度鉴定实践。赵虎基等(2000)对西瓜种内12个品种(系)进行了核型分析，据其染色体的对称性、着丝点位置等核型参数推断出了它们之间的相对进化程度，揭示了其亲缘关系的远近，从而对西瓜亲本的选择选配和遗传育种研究提供了一定的理论依据。李艳梅等(2007)用AFLP标记对57份西瓜材料进行了多态性分析，根据DNA谱带计算品种间遗传相似系数，其范围在0.24～0.99之间，平均相似系数为0.70，表明西瓜品种间遗传基础狭窄。2遗传图谱的构建利用分子标记构建遗传连锁图谱，将对西瓜遗传育种及其重要性状基因的定位、克隆具有重要意义。目前，已发表的西瓜分子图谱有10余张。Hashizume(1995)用一个近交系(H-7；Citrulluslanatus)和一个野生类型(SA-1；Citrulluslanatus)杂交获得的BC1群体[(H-7×SA-1)×SA-1]构建了一个最初的西瓜分子遗传连锁图谱，该图谱包括58个RAPD标记，1个同工酶标记，1个RFLP标记和2个形态标记，分为11个连锁群，全长524cM，Hashizume等(2003)又用以上两个亲本杂交的F2群体为材料进行了图谱构建，该图谱包括477个RAPD位点、53个RFLP位点、1个同工酶位点及23个ISSR位点，分为11个连锁群，覆盖了2384cM的分子图谱，同时对果皮硬度、果肉颜色等进行了QTL定位。Hawkins等(2001)用枯萎病抗感不同品种NHM×PI296341获得的杂交F2、F3群体，分别构建出两张涵盖112.9和139.0cM的RAPD连锁图，许多RAPD标记和枯萎病生理小种1(Fom-1)和2(Fom-2)的抗性基因有不同程度的连锁。Levi等(2001，2002)用(PI296341-FR×NHM)×NHM的BC1群体，构建出总长1295cM、含有17个连锁群、155个RAPD标记和1个SCAR标记的分子遗传连锁图谱，之后利用测交群体(Griffin14113×NHM)×PI386015构建了总长1166.2cM的遗传连锁图谱。范敏等(2000)用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系(Citrulluslanatusvar.1anatus)97103与可溶性固形物含量低、皮厚、抗枯萎病的野生西瓜种质(C.lanatusvar.citroides)PI296341含有96个标记的连锁遗传图谱，该图谱由11个连锁群构成，覆盖基因组长度为1203.2cM，位点间平均间距为12.53cM，总的位点数为96个，包括85个RAPD标记、3个SSR标记、3个同工酶标记、4个形态标记及1个抗枯萎病生理小种1的基因标记。张仁兵等(2003)用同样的亲本杂交所得的重组自交系F8的群117个单株作图群体，构建了包含87个RAPD标记、13个ISSR标记，分为15个连锁群，覆盖基因组1027.5cM。易克等(2003)用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜种质PI296341作为亲本，获得F8的重组自交系群体，用SSR和ISSR标记技术构建了包括38个SSR标记和10个ISSR标记组成的分子图谱，该图谱总长558.1cM，平均图距为11.9cM，之后易克等(2004)用同样亲本获得F2S7重组自交系群体，通过AFLP技术对群体扩增，建立了有150个标记组成的图谱，包