分子生物学大实验操作指南

1分子生物学大实验操作指南单林娜王莲哲编常用试剂的配制方法（一）配方1、1MTris-HCl,pH8.0,500ml60.55gTris+400mlH2O+约26ml浓HCl2、0.5MNa2EDTA，pH8.0,200ml（EDTA难溶于水，应优先配制，并加入适量NaOH助溶）37.22gEDTA+180mlH2O+约8gNaOH片（若是EDTA二钠盐可减半）3、10%葡萄糖10g葡萄糖+90mlH2O4、1MNaOH：4gNaOH+96mlH2O5、KAc(3MK.5MAc)（9.814×3）gKAc+30mlH2O+11.5ml[60.5×2/1.049]冰醋酸+28.5mlH2O——定容至100ml（溶液III:KAc14.7g,HAC5.8mL,加水至50mL。乙酸；醋酸；冰醋酸【英文名称】aceticacid【结构或分子式】CH3COOH【相对分子量或原子量】60.05【密度】1.049醋酸钾(医药级)C2H3KO2F.W.98.14）6、70%乙醇7、TE50ml：10mmol/LTris-HCl,pH8.0，1mmol/LEDTA，pH8.01MTris-HCl（pH8.0）0.5ml0.5MNa2EDTA（pH8.0）0.1mlH2O49.4ml8、CTAB抽提液100ml：2%CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）100mmol/LTris-HCl,pH8.0/1MTris-HCl（pH8.0）10ml20mmol/LEDTA，pH8.0/0.5MNa2EDTA（pH8.0）4ml1.4mol/LNaCl(8.18g)（二）操作步骤1、刷洗试剂瓶等玻璃器皿清水——去污粉——清水4遍——蒸馏水2遍2、按配方配制试剂计算用量写出配方——称量（学习掌握电子天平用法）——混溶3、灭菌（复习巩固压力锅用法）实验一总DNA提取（4学时）（一）总DNA提取1．目的：学会提取纯化DNA的试剂的配法，学会使用离心机、移液器，掌握总DNA2的提取和纯化技术。2．实验原理：在SDS或CTAB物质存在时，经机械研磨，使细胞破裂并释放出内含物，提取DNA。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度的溶液中沉淀核酸和酸性多聚糖的特性，在这种条件下，蛋白质和中性多聚糖仍留在溶液里，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA。提取DNA所用的提取液、吸头、离心管等需要高压灭菌以灭活DNase。3．实验器材和试剂试材：刺蛾蛹仪器、用具：离心机、离心管、微量移液器、吸头、吸水纸、水浴锅、冰箱、研钵、液氮罐、电子天平、pH计、高压灭菌锅、一次性手套和口罩等。4．实验准备：需配置的药品和缓冲液：提取DNA缓冲液（CTAB法）:2%CTAB(W/V),100mmol/LTris-HCIpH8.0,20mmol/LEDTApH8.0,1.4mol·L-1NaCl，2%PVP(灭菌后加入2%PVP，使之充分溶解）。在研磨叶片前加入1%（V/V）ß-巯基乙醇。TE(pH8.0):称取1.211gTris、0.372gEDTA-Na2，先用800mL蒸馏水加热搅拌溶解，用盐酸调pH8.0，再用蒸馏水定容至1000mL。高压灭菌20min。氯仿/异戊醇（24:1,v/v）:将氯仿和异戊醇按体积24:1的比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)：按饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为25:24:1比例混匀，置棕色瓶中，4℃保存。5．操作步骤：（1）将单头蛹放入1.5ml离心管中，加入足量液氮充分研磨；（2）吸取500μl65℃预热的2×CATB缓冲液[0.1MTris-HCl(PH8)，1.4MNaCl，0.02MEDTA，2%CTAB,0.2%α-巯基乙醇]，注入管中少许，继续研磨后，将余液全部注入；（3）匀浆物置于65℃孵育45~60min，中途混匀数次；（4）短暂离心，将上清液转至一只新管，沉淀用200μl2×CATB再悬浮，孵育20~30min后离心；（5）将两次的上清液合并，用等体积的苯酚/氯仿（1/1）抽提，12000rpm离心10min;（6）水相用等体积的氯仿再抽提一次，12000rpm离心10min;（7）水相与2/3体积异丙醇混合，4℃放置1小时至过夜；（8）10000rpm离心15min使DNA沉淀；（9）用70%乙醇漂洗，干燥，加0.1×TE40μl再悬浮。（10）－20℃保存。（二）总DNA提取产物电泳鉴定1．目的：学会常用的DNA琼脂糖凝胶电泳、。2．原理：DNA分子在电场中会向正极方向移动。不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。3．试剂：（1）电泳缓冲液：TAE：Tris-醋酸缓冲液或TBE：Tris-硼酸缓冲液（2）上样缓冲液：一般为6×浓缩液3（3）溴乙锭（10mg/ml）（4）1.5%~2%琼脂糖总DNA提取物，DNA分子量标准。4．实验准备配制TAE电泳缓冲液（50´储存液，pH约8.5：Tris碱242g，57.1ml冰乙酸，37.2gNa2EDTA.2H2O，ddwater定容至1L），6´加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖水溶液）；1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。5．操作步骤（1）称取0.4g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入50mlTAE电泳缓冲液(1´)，放入微波炉中烧开（1min）。注意观察烧瓶中的琼脂糖粉末，待完全熔化后停止微波炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。（2）戴上线手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约50-60°C）。（3）把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮边缘相平即可，不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置10-20分钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。（4）在水平电泳槽中加满1´TAE电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调至170V(10V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。（5）待胶完全凝固后（15-20分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，凝胶要没入电泳液中。凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。（6）在凝胶上选择相邻的加样孔。用10ml的吸液头取管中DNA5~9μl，加入凝胶的加样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入1.5-3mlDNA分子量标准物）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色的样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。（7）打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前移动（如果发现蓝色向后移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约30min。（8）当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘1cm时，关闭电源。取出模具和凝胶。放入凝胶成像系统中拍照。实验二PCR扩增制备目的基因（4学时）（三）PCR扩增制备目的基因1．目的：掌握聚合酶链式反应的基本原理和实验技术方法。2．原理：多聚酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。（1）变性：加热使模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。（2）退火：使溶液温度降至50—60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段。（3）延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5’3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25~30个循环后4DNA可扩增106~109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。3．仪器、材料与试剂仪器：（1）PCR热循环仪（2）琼脂糖凝胶电泳系统试剂：（1）引物：根据待扩增DNA不同，所用引物也不同。选择引物时要符合一般引物设计的原则，必要时要用微机进行结构分析。采用通用引物TY-J-1460（5’-TACAATTTATCGCCTAAACTTCAGCC-3’）和C2-N-3661（5’-CCACAAATTTCAG-AACATTGTCCA-3’）（Simonetal，1994），进行刺蛾蛹的COⅠ、COⅡ及tRNA基因扩增。（2）耐热DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌分离出来，能耐受93～100C的高温而不失活。（3）10×PCR缓冲液：250~500mmol/LKCl100~500mmol/LTris-HClpH8.415~20mmol/LMgCl20.5%Tween-201mg/LBSA(fictionV)无核酸酶（4）dNTPs储存液：i.有商品化的中性混合液(2mmol/L,10×)供应，如需自己配制，则将dATP、dCTP、dGTP、dTTP钠盐各10mg溶入2ml去离子水（浓度为5mmol/L），用0.1molNaOH调至pH7.0~7.5，分装，-20C保存。（5）样品处理试剂：不同样本所需试剂不同，根据具体情况而定。4．实验准备TAE电泳缓冲液，1000´溴化乙锭储存液（0.5mg/ml），10´加样缓冲液，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。5．操作步骤在0.2mlPCR微量离心管中配制25μl反应体系。PCR反应体系为：10×ExTaq缓冲液2.5μl2.5mMdNTPs1.1.5μl25mMmagnesium2.0μl，20μM上游引物0.3μl20μM下游引物0.3μl5Uμl-1ExTaqDNA聚合酶0.2μl5~10ngμl-1总DNA模板1.5μl纯水16.7μl,总体积25.0μlPCR反应条件是：1)95℃5min预变性，2)94℃40sec，3)52℃50sec，54)72℃2min，5)重复2）—4），共35个循环，6)72℃延伸10min；7)4℃保持。PCR产物电泳鉴定同（二）。取PCR反应产物5~9μl，在1%琼脂糖凝胶上，5V/cm电压电泳50min。紫外灯下观察结果。实验三目的基因纯化及其与载体的连接（4学时）（四）扩增目的基因片段的回收与纯化在紫外透射仪下迅速切取含有目的基因片段的凝胶条,将其装入1.5mL的离心管中,按北京天为时代公司的琼脂糖凝胶DNA回收Kit说明书进行。操作流程：（1）用干净刀片切下含DNA的琼脂凝胶块，称其重量,加3倍体积溶胶液;(约500μl)（2）65℃水浴10min，直至胶块完全溶解，降至室温;最好在冰上放一会。（3）将溶液加入离心吸附柱中冰浴2min，12000rpm离心30sec,弃掉废液;（4）加700μL漂洗液，12000rpm离心30sec,弃掉废液;（5）加500μL漂洗液，12000rpm离心2min,弃掉废液,取出吸附柱，放入一干净离心管中，加适量(50μl)洗脱缓冲液溶解(EB先在65℃－70℃水浴中预热)室温放置2分钟,12000rpm离心1分钟。置-20℃保存备用。注：PCR产物可以直接与T载体连接，然后转化感受态细胞。（五）COⅠ和COⅡ目的基因片段与克隆载体质粒的连接1．目的：学会DNA片断的体外连接技术。2．原理：在Mg2+和ATP存在下，T4DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。3．操作步骤按pMD18-TVector提供的方法，将PCR扩增产物COⅠ、COⅡ及tRNA基因与