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Squarelu2013级1第7章、基因操作1.PCR过程中的DNA模板变性、模板与引物退火、引物延伸3步的温度设置一般大致是多少？要考虑的主要因素是什么？DNA模板变性(denature)：95℃左右高温使模板DNA完全变性。单链DNA模板与引物退火(annealing)：55℃左右引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性。引物的延伸(extension)：72℃左右耐热DNA聚合酶在最适温度下催化DNA合成反应。2.衡量PCR好坏的参数主要有哪些？一般来说好的结果如何体现？特异性Specificity:最好只有目的DNA带。真实性Fidelity:DNA序列正确。产量Quantity:DNA带明亮。3.以TaqMan技术为例，简述实时荧光PCR的原理。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号；每扩增一条DNA链就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。4.用于核酸探针标记的32PATP有几种，DNA切口平移标记法、随机引物标记法和5′末端标记分别应该用哪种？为什么？2种：r-32PATP、a-32PATP(1)DNA切口平移标记法：[α-32P]-dCTP(2)DNA随机引物标记法：[α-32P]-dCTP(3)DNA的5’末端标记法：[γ-32P]-ATP(4)DNA的3’末端标记法:[α-32P]-dCTP32P的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度极高；特异性极高；对各种酶促反应无任何影响,也不会影响碱基配对的特异性与稳定性和杂交性质。5.简述采用Biotin标记探针进行North-South杂交原理和操作流程。①DNA电泳,转膜，紫外交联固定②洗膜封闭(地高辛标记)③杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合③杂交：Dig标记的探针与靶DNA结合④HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合④HRP/AP标记抗体与Dig结合⑤底物在HRP催化下,反应发光⑤底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光6.简述蛋白质印迹技术WesternBlotting间接法操作流程。与直接法相比较，主要的差别是什么？①电泳分离,转膜,固定蛋白于膜上②漂洗和封闭直接法操作流程:③一抗与蛋白结合(小鼠单抗或兔多抗)③HRP/AP标记抗体与蛋白结合④HRP,AP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合④底物与抗体-HRP/AP反应,显色或发光⑤底物与二抗-HRP,AP反应,显色或发光主要的差别：1.免疫特异性不受标记影响2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）3.多种标记的二抗可供选4.可选择不同的Marker7、Southern印迹杂交是将经凝胶分离的DNA转移到合适的固相支持物，再通过特异性探针的杂交来检测被转移的DNA片段的一种技术。程序：限制性内切酶消化DNA→琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段→转印到NC膜或尼龙膜→碱变性、中和→预杂交、杂交→放射性自显影.其基本原理---毛细管转移8、Northern印迹杂交程序:将RNA样品变性和通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，再转移到NC膜等固相载体上，用标记的DNA或RNA特异探针对固定在膜上的RNA进行杂交。Squarelu2013级2两者基本原理;，变性方法不同点。9.基因操作技术在医学方面的应用主要包括？（1）基因分析——疾病相关基因和疾病分子机制的分析；（2）基因诊断——建立新的疾病诊断方法；（3）基因治疗——纠正人类基因缺陷的方法；（4）法医学鉴定——发展出新的法医学鉴定方法；（5）高效率、低成本生产用于疾病防治的生物活性蛋白质、细胞、器官。10.简述显微注射法建立转基因鼠技术路线。目的基因（微注射）V（移植）(妊娠出生)（分子检测）供体动物---受精卵---受体动物输卵管---动物幼崽---转基因动物11.简述获得2012年诺贝尔生理学或医学奖的诱导式多能性干细胞技术的原理？ES（胚胎干）细胞和IPS（诱导多能干细胞）具有相同的基因，不同的是ES细胞中的与细胞多能性有关的基因能够表达，如oct4、Sox2等。而已分化的体细胞中的这些基因不能表达。通过导入与多能性有关的外源基因来激活体细胞中的多能性基因，从而是体细胞从分化状态重编程为多能性干细胞。十四章、生物芯片12.简述生物芯片的基本原理和特征？概念：指通过微电子和微加工技术，将大量已知序列的核酸或蛋白片段等，有序地组合在1CM2大小固相介质表面而构成的集成分析系统。可与标记的核酸或蛋白分子特异结合，实现对核酸、蛋白等生物组分的快速、高效、敏感的处理与分析。“分子杂交”原理：生物分子间的相互特异识别作用（如:DNA分子之间、蛋白分子之间、DNA与蛋白分子之间以及自组装单分子膜之间等）“芯片”特征：高通量、高集成、并行化、微型化、自动化、连续化。13.简述基因芯片、蛋白质芯片各自在生物医学中的应用主要有哪些？基因芯片：基因差异表达谱分析、DNA测序、基因突变的检测、基因诊断、药物研究开发蛋白质芯片：寻找疾病诊断依据的标志性蛋白质分子寻找药物作用靶蛋白药物疗效、毒副作用评价14.简述采用DNA芯片作基因差异表达谱分析的基本过程；在图像重叠分析中为何出现红、黄、绿3种颜色，各表明什么？(1)探针的设计与芯片的制作(2)待测样品核酸的提取、扩增与标记(3)杂交反应与杂交后清洗(4)扫描与分析(5)结果与讨论不同来源的样品分别用不同颜色的荧光素标记(Cy3为红色,标记处理组；Cy5为绿色,标记对照组)，以便比较分析红色表示上调；黄色表示不变；绿色表示下调15、蛋白质分离纯化的一般原则：蛋白质分离纯化的依据，不同蛋白质由于氨基酸数目和序列不同，立体结构不同，物化性质不同。1）.材料的选择与破碎2）.建立蛋白质的活性测定方法3）.分离纯化应遵循分级分离、先粗后细的原则4）.分离纯化条件16、分配层析定律：Squarelu2013级3（1）假设有两种互不混溶的溶剂S和M，将A物质溶于一定量的S溶剂中，再加入一定量的M溶剂，（2）A物质在两相中相互扩散，（3）A物质在两相中达到了平衡(在同一时间内，进出两相的A物质的分子数完全相等)时，其分配系数为常数：CAS/CAM=K。分配定律表明：一定的条件下，一定的物质其K值不变，条件改变其K值随之改变，K值大于1，物质在S相中的浓度大于其在M相中浓度。17、蛋白质的层析分离技术（主要掌握操作要点及操作过程的注意事项）离子交换层析操作要点凝胶过滤层析操作要点亲和层析样品的准备样品的准备剂型的选择凝胶的选择与处理离子交换剂的预处理装柱(样品体积的2-5倍）装柱（L:W=50-100:1）柱效应的标定柱填充的检测上样上样（1%-5%)洗脱（分步洗脱法、梯度洗脱法）洗脱目的蛋白的鉴定与回收目的蛋白的鉴定与回收离子交换剂的再生与储存层析柱再生与储存18、蛋白质的电泳分离技术1）不连续系统原理（重点掌握）在不连续电泳系统中，含有三种离子，两种不同孔径的凝胶，两种或两种以上不同pH的缓冲溶液，所谓不连续就是指凝胶浓度不一样，缓冲液离子成分，pH及电位梯度不一样，在不连续电泳系统中，有三种物理效应，即样品的浓缩效应、分子筛效应及电荷效应，由于这三种物理效应，使样品分离效果好，分辨率高。四个不连续性：(1)凝胶层的不连续性：浓缩胶、分离胶(2)缓冲液离子成分的不连续性：快离子(前导离子)、慢离子(尾随离子)、缓冲配对离子(缓冲抗衡离子);(3)电位梯度的不连续性：在不连续系统中，电位梯度的差异是自动形成的。(4)pH的不连续性：浓缩胶pH：6.7：分离胶pH：8.9；缓冲液pH：8.3。在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。由于电泳基质的上述四个不连续性，使样品在电泳开始时得以浓缩，然后再被分离。蛋白质的定性定量分析19、蛋白质相对分子量测定(SDS-PAGE)SDS-PAGE技术（重点掌握）SDS作用：与蛋白牢固结合，浓度大于1mmol/L时，与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖蛋白质分子间天然的电荷差异。这种复合物的分子构型几乎相同，具有相同的荷质比，使其不再受所带电荷及分子形状的影响，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，且一定条件下，两者呈对数线性关系。SDS-PAGE凝胶的制备：电泳槽的安装凝胶的制备（分离胶的制备、浓缩胶的制备）装板—安装凝胶板加样电泳卸板并进行凝胶染色Squarelu2013级4细胞信号转导20.受体Receptor概念:位于胞膜或胞内的能特异识别和结合信息分子，并转导信号引起生物学效应的一类生物大分子。大多数为蛋白质。配体（ligand）:与受体特异结合的信息分子称为配体。受体作用特点：高度的专一性、高度的亲和力、可饱和性、可逆性、产生特定的生理效应。.对比几种膜受体的结构、作用机理和相应配体膜受体结构作用机理配体G蛋白偶联受体（GPCRs）7个α-螺旋七跨膜受体蛇形受体H+R→受体变构→结合G蛋白→形成H-R-Gp复合体激素和神经递质Adr、ACTH、光、气味配体门控离子通道受体环状受体H+R→离子通道打开或关闭→改变膜的通透性阴离子通道受体甘氨酸、γ氨基丁酸阳离子通道受体乙酰胆碱单（个）跨膜α螺旋受体蛋白酪氨酸激酶PTK受体H+R→即具有PTK活性胰岛素、多种生长因子蛋白丝/苏氨酸激酶受体H+R→即具有蛋白丝/苏氨酸激酶活性转化生长因子-β细胞因子受体（分四型）H+R→活化PTK→底物磷酸化细胞因子、生长激素鸟苷酸环化酶活性受体膜受体：三聚体或四聚体多种结构域H+R→GC活化心钠肽（ANP）和鸟苷蛋白胞内受体：α、β亚基异源二聚体，结合结构域NO、CO21、列表对比几条胞内信号转导通路的agonist,receptor,keyenzymes,secondmessengersandbiologicalfunctions.信号转导通路配体受体关键酶第二信使生物学效应cAMP-蛋白激酶A途径激素其他信号分子GPCRPKA蛋白激酶AcAMP调节代谢、基因表达cGMP-蛋白激酶G途径心钠肽、NO和鸟苷蛋白鸟苷酸环化酶(GC)PKG蛋白激酶GcGMP如心钠肽、CO、NO舒张血管、利尿Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶途径激素、生长因子、神经递质GPCRCa2+-磷脂依赖的蛋白激酶PKCDAG二酯酰甘油IP3三磷酸肌醇Ca2+调节代谢、基因表达细胞分化、增值Ca2+－钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径激素、生长因子、神经递质GPCRCa2+/CaM依赖的蛋白激酶CaM-PKIP3、Ca2+调节代谢、基因表达22、cAMP-蛋白激酶途径、Ca2+依赖性蛋白激酶途径及cGMP-蛋白激酶途径的主要过程并比较它们的异同。跨膜信号转导的一般步骤：特定的细胞释放信息物质扩散或血循环到达靶细胞与靶细胞的受体特异性结合受体对信号进行转换并启动细胞内信使系统靶细胞产生生物学效应。（1）、cAMP-蛋白激酶途径：受体变构ATP丝/苏氨酸磷酸化H+R→→Gs激活→→激活AC→→激活cAMP→→激活PKA→→蛋白质磷酸化→→生物学效应Squarelu2013级5（2）、Ca2+依赖性蛋白激酶途径:Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶途径受体变构PIP2DAG↑→→激活PKC→→蛋白质磷酸化→→生物学效应H+R→→Gq激活→→激活PLC→→↑↑IP3↑→→Ca2+→→CaM↑→→CaM-PK↑→→生物学效应H+R→受体二聚体化→受体的TPK活化Ca2+－钙调蛋白依赖性蛋白激酶途径（3）、cGMP-蛋白激酶途径：受体变构GTP丝/苏氨酸磷酸化H+R→→激活GC→→激活cGMP→→激活PKG→→蛋白质磷酸化→→生物学效应（4）、酪氨酸蛋白激酶途径：Ras-Raf-MAPKpathwayH+R→→激活Ras蛋白→→激活Raf蛋白→→激活MAPK系统→→蛋白质磷酸化→→生物学效应JAKs-STATpathwayJAKs活化JAKsH+R→→激活受体→→激