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一、样品的准备采样准备：布袋，剪刀，手术刀，样品袋，液氮，以上东西需经过高压灭菌。采样过程：采样时不要说话，佩戴乳胶手套，迅速采集小块组织装入样品袋或锡箔纸包装后，快速放入液氮，放时注意样品的充分冷却，回到实验室放入-70度。注意采样时注意要迅速，以防RNA降解。二、RNA提取1、准备东西：高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子，蓝黄枪头。2、使用器具尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前安下列方法进行处理试剂配制及器具处理①0.1％的DEPC（焦碳酸二乙酯）)水②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC水中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。③无RNA酶灭菌水（DEPC处理过的水）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%（体积/体积）加入的DEPC处理过夜，拧松瓶盖，高压灭菌。80℃烘4h以上。④Trizol⑤75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。⑥氯仿⑦异丙醇3、操作步骤（具体需要参照产品说明书）Trizol法提取总RNA①先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。②室温放置5min，然后加入200µl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。③12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500µl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。⑤重复步骤④。⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30µlDEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。[注意]①整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。②加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。琼脂糖凝胶电泳检测RNA三、RT-PCR扩增目的基因cDNA1、试剂①RNA模板②Olig（dT）18③反转录缓冲液④dNTP⑤M-MULV反转录酶⑥RNA抑制剂（RNasin）⑦PfuDNA聚合酶或TaqDNA聚合酶⑧10×PCRbuffer⑨特异引物（PCR）2、设备PCR扩增仪、电泳仪、台式离心机、恒温水浴、微量移液器，DEPC处理的枪头。3、操作步骤3.1RNA的反转录①在小EP管中依次加入RNA模板3μl（依据RNA浓度加）Olig（dT）18引物1μLDEPCH2O8μL混合后，70℃水浴5min（破坏二级结构），再冰浴5min，瞬时离心收集液滴。②在管中依次加入(反应体系为20μL)：RT5×buffer4μLRNasin1μLdNTP(10mM)2μL混匀，37℃5min。M-MULV反转录酶1μL置于42℃，1h。③70℃保温5min（使酶失活）。④于-20℃保存备用。3.2PCR扩增目的基因3.2.1用克隆引物扩增目的基因在灭菌的PCR管中，依次加入（50ul体系）模板（反转录产物）1μl10×PCR缓冲液3μldNTP0.5μl克隆引物B11μl克隆引物B21μlPfuDNA聚合酶0.5μlddH2O23μl混匀后按下面的设置程序进行扩增。94℃3min94℃45Sec30cycles:55℃45Sec72℃45Sec（依据片断大小设置，经验数据500bp/30sec）72℃5minPCR产物进行1%琼脂糖电泳分析鉴定，同时进行回收（参见附录1）。四、核酸琼脂糖电泳分析1、试剂①TBE缓冲液（10×）：用时需稀释10倍②点样缓冲液Loadingbuffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油③溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶。注意：EB具致癌作用。④琼脂糖2、器材电泳仪系统、凝胶成像系统3、操作步骤3.1琼脂糖凝胶的制备称0.2g琼脂糖加入20mlTBE缓冲液中加热熔解，放置至手背不烫时加入EB或者后边浸泡。3.2胶板制备将凝胶槽清洗干净，在一端插好梳子。然后倒入熔化好的琼脂糖，待凝胶完全凝固后，将凝胶槽移至电泳槽（槽中已加入TBE缓冲液），拔掉梳子。注意：缓冲液要高出胶面2mm。3.3点样每个样品中加入1/10体积Loadingbuffer（10×），混匀后小心地加入点样孔中，要避免相互污染。3.4电泳接通电源，80V电压电泳1h左右，当溴酚蓝到达下沿1~2㎝处时终止电泳。3.5观察及照相将胶板拿出，在EB溶液中浸泡数分钟后，用凝胶成像系统照相。五、PCR产物纯化参照安徽优晶说明书：使用前应准备的材料：·10,000xg的以上离心机·1.5ml灭菌离心管·无菌去离子水或TE缓冲液·无水乙醇·防护眼镜回收纯化操作方案：请您在正式操作之前仔细阅读本说明书确保完全熟悉操作方案，该试剂盒设计简单、快速、可靠，且为您提供了所有的操作步骤，所有的离心步骤都必须在室温下进行。1、进行琼脂糖凝胶－EB电泳以分析PCR产物。2、确定PCR反应产物体积，将PCR产物转移至一个1.5ml离心管中，加入等体积的PP-II缓冲液。对于小于200bp以下PCR产物需要加2倍体积的PP-II缓冲液，旋涡混匀。3、将样本加入到一个Mu-PuDNA回收纯化柱上，柱子事先装在一个干净的2ml收集管内，室温下10,000xg离心1分钟，弃去流出液。4、用700ul已用无水乙醇稀释SPW洗涤缓冲液洗涤柱子，室温下10000xg离心1分钟。注意：SPW洗涤缓冲液在使用前必须按瓶上标签提示用无水乙醇稀释。5、弃去流出液，重复第4步一次。6、弃去流出液，将空柱10,000xg离心1分钟，以甩干柱子基质。此步对于从柱上去除乙醇相当重要，否则会影响到下游的应用。7、把柱子装在一个灭菌干净的1.5ml离心管上，加入30-50μl(取决于最终产物的浓度)无菌去离子水或TE缓冲液到柱子上，10,000xg离心1分钟洗脱出DNA，这样可以得到80-90%的结合DNA，如果再进行一次洗脱，可以把残余的DNA洗脱出来，只是浓度较低。8、DNA的产量和质量把提取得到的样品稀释一定倍数后，分别在260mm和280mm下测光吸收值，回收得到DNA浓度下按下列公式计算：[DNA浓度]=A260×50×稀释倍数ug/ml长度大于500bp的片段回收率可大于80%，而50bp-500bp的片段只能达到60%-90%。A260/A280值代表核酸纯度，如果比值大于1.8，则意味着核酸纯度大于90%，另一方面，产量高低有时也取决于琼脂糖凝胶-EB电泳。六、载体和外源DNA的连接反应1、试剂①目标DNA片段（PCR扩增产物）②载体（pMD18-T,pGEX4T-1）③10×ligation缓冲液④T4DNA连接酶⑤ddH2O2、设备台式离心机、恒温水浴、微量移液器3、操作步骤4、克隆载体与目的片断的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：pMD18-T1μl目的片段4μllSolutionⅠ(含连接酶和buffer)5μl离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃过夜（12小时）连接。5、表达载体与目的片断的连接取一个200µl的EP管依次加入下列试剂：2×buffer：5μlpGEX4T-1酶切回收产物：1μlPfu扩增并酶切回收的片段：3μlT4连接酶：1μl离心30Sec，使反应体系充分混合，16～22℃连接3～4h。七、感受态细胞的制备及转化（CaCl2方法）1、实验材料大肠杆菌DH5α或BL21（DE3）PlysS2、试剂①LB培养基（液体和固体培养基配置方法参见附录2）②氨苄青霉素3、设备培养皿、带帽试管、涂布器、冷冻离心机、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床4、操作步骤4.1感受态的制备①从LB平板上挑取单克隆于5mlLB培养基中，37℃200rpm摇菌12～16h。②将活化过的菌按1％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4(小于0.4都可)。（感受态是一种能吸收外源物质的生长状态，因此OD值不能过了）。③菌液转移到50ml离心管中，冰上放置10min。④6000转/min，离心10min。⑤倒出培养液，将管倒置1min，以使流尽培养液6.用冰冷0.1mol/LCaCl2（灭菌预冷）10ml温和悬浮沉淀，立即放于冰上保温30min.7.0-4度4000转/min，离心10min。8.用冰冷的CaCl2（灭菌预冷）2ml温和悬浮细胞(务必放于冰上)9.冻存时每4mlCaCl2加140ulDMSO10.冰上放置15min后再加140ulDMSO11冰上放置15min后200ul分装。注意：①无菌操作和保持低温。②培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。③如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。4.2转化①将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10μl连接产物（若加质粒，则只需加1μl），温和混匀，冰浴20~30min。②42℃热激90S。冰浴1-2min。③加入800μLLB液体培养基，37℃培养60min。使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性基因。4.将适当体积的（90mm平板达200ul）已转化的感受态转移到含有抗生素的LB培养基上。④取含有50～100μg/mlAmp的LB平板培养基（若进行蓝白斑筛选，在培养皿上先涂布4μl200mg/ml的IPTG和40μl20mm/ml的X-Gal），涂板。⑤37℃倒置培养12~16h。八、克隆的筛选和快速鉴定1、试剂①TaqDNA聚合酶②10×buffer（含MgCl2）③dNTP④Loadingbuffer2、设备电泳仪、1.5mlEP管、培养皿、PCR扩增仪、台式离心机3、操作步骤7.3.2菌落PCR鉴定法直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入25μ的PCR反应体系中。参照自己PCR体系加样。试剂体积（30μl）ddH2O22.5μl10×buffer3μldNTP1μl克隆引物B11μl克隆引物B21μl模板(单菌落)1个Taq酶(2.5u)0.5μl用特异引物进行PCR，电泳检测PCR产物，挑选对应的阳性克隆菌落。做如下记录：九、提取质粒参考优晶提取质粒说明书：使用者需备：10,000xg以上高速离心机1.5ml的灭菌干净小离心管灭菌去离子水(或TE缓冲液)无水乙醇(96%~100％)15ml离心管及其配套离心机（仅ZL-2-1和ZL-2-2）注意一、使用前往准备好的ZL-I缓冲液中加入RNaseA，保存于4℃。二、DNA洗涤缓冲液需用无水乙醇按如下稀释：ZL-1-1-1ZL-1-2-1ZL-2-1-1ZL-2-2-1加入12ml无水乙醇ZL-1-1-2ZL-1-2-2ZL-2-1-2ZL-2-2-2加入80ml无水乙醇ZL-1-1-3ZL-1-2-3ZL-2-1-3ZL-2-2-3每瓶各加入80ml无水乙醇三、稀释后的DNA洗涤缓冲液需室温保存；四、所有步骤必须在室温下操作。H.Q.&Q.质粒微量提取方案产品编号：ZL-1-1和ZL-1-2A．样本准备将带有目的质粒的E.coli接种于裝有5mlLB/氨苄青霉素(50μg/ml)培养基的10~20ml培养管中，37℃搖床培养12~16hr，以扩增质粒。注意不要于37℃下培养菌种时间过长或长时间存放培养物，这对质粒分离的产量是不利的。建议使用endA敏感型的E.coli菌株来作常规质粒的分离，例如DH5α®和JM109®等菌株。B．操作方案1.取1.5~5ml的菌液，于室温