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金属硫蛋白的提取与纯化1应用荧光技术检测细胞中二硫键张璇摘要：金属硫蛋白(metallothionein，MT)是一类低分子量、富含半胱氨酸、可被金属诱导的特异性蛋白质。本文主要介绍从动物体内真核表达经过凝胶过滤、离子交换、亲和层析等方法纯化获得金属硫蛋白，并制得脱金属硫蛋白用来制备重组Zn-MT。关键词：金属硫蛋白(MT)，纯化，超滤，Zn-MT1实验方案及原理1.1实验方案蛋白质是生命现象的物质基础之一，是生物体最重要的组成部分，要得到各种蛋白质，往往从动植物体内直接提取开始。本试验采取文献[1]记载的方法，用重金属镉诱导兔肝产生Cd-MT，有机溶剂沉淀法提取蛋白质后，过分子筛分离出金属硫蛋白，又利用离子交换的方法将MT1与MT2分开，获得两种不同的金属硫蛋白。锌离子对于地球上的生物来说是一种很重要的营养物质。这种金属元素在许多生物活动中都起着很关键的作用。在肝合成的Zn-MT被认为是体内锌的储备和转运形式，即“锌池”，可被其他组织利用。为了获得Zn-MT，本试验采用文献[2]记载的方法，用DTT进行巯基保护后在强酸的条件下使金属硫蛋白上的金属脱离，过分子筛把它们分离，获得脱金属硫蛋白。再加入过量的Zn以获得Zn重组金属硫蛋白。1.2技术路线1.2.1真核表达金属硫蛋白的提取与纯化金属硫蛋白的提取与纯化2新西兰兔↓Cd诱导产生Cd-MT↓有机溶剂沉淀法得兔肝粗提液↓分子筛分离金属硫蛋白↓离子交换层析分离MT1,2↓离子交换层析浓缩↓MT1,2图1-1兔肝中金属硫蛋白的纯化步骤1.2.2脱金属硫蛋白以及Zn重组金属硫蛋白的制备图1-2脱金属硫蛋白制取Zn重组硫蛋白步骤1.3实验原理1.3.1有机溶剂沉淀法提取蛋白质细胞外液体活细胞抽提物中的水溶性蛋白质可与水混融的有机溶剂沉淀。常用的两种有机溶剂是乙醇和丙酮。向蛋白质水溶液加入这些有机溶剂则可降低水对带电的亲水蛋白质分子的溶解力，使蛋白质聚合和沉淀。影响沉淀的要点是蛋白质分子的大小。其他条件相同时，蛋白质分子越大，沉淀蛋白质所需有机溶剂Cd-MT↓DTT巯基保护↓强酸条件脱掉金属↓分子筛提纯↓apo-MT↓加过量的Zn2+↓超滤脱盐↓Zn-MT金属硫蛋白的提取与纯化3量越少。在蛋白质的等电点附近，较低浓度的有机溶剂也能使蛋白质沉淀。这个事实支持了下述家说：有机溶剂使蛋白质沉淀（聚合）可能是由于蛋白质结构中的静电力和偶极范德华力暴露出来，并相互作用的结果。用有机溶剂沉淀蛋白质时，温度要保持在0oC左右，防止有机溶剂与水混合时产生的热使蛋白质变性。含蛋白质的抽提液和有机溶剂都要预冷，然后才能加入有机溶剂。加入的速度要相当慢，搅拌要充分，防止局部有机溶剂浓度过高。加入有机溶剂后，可通过离心，小心倾出上清而除去沉淀。对沉淀交替抽空、放空几次，以除去沉淀中残余的有机溶剂，直至检测不出有机溶剂为止。然后将沉淀溶解在最少量的适当缓冲液中[3]。1.3.2表达产物的获取细胞破碎指用一定的方法在一定程度上破坏细胞壁和膜，设法使胞内产物最大程度释放到液相中去。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。细胞的破碎根据作用方式不同，基本可分为两大类：机械法和非机械法。实验室一般采用的超声破碎法属于机械法，即输入高能超声波破碎细胞，由于超声波的空穴作用引起的冲击力和剪切力可以使细胞破碎。空穴作用是在超声波作用下经历气泡形成，长大和破碎，在气泡破碎期间，大量声能被转化为机械能，引起局部的剪切使细胞破碎。1.3.3表达产物的纯化1.凝胶过滤层析（GelFiltrationChromatography,GFC）凝胶过滤层析是利用具有多孔网状结构的凝胶颗粒的分子筛作用，根据被分离样品中各组分分子量大小的差异进行洗脱分离的一项技术。该技术在分离纯化蛋白质时具有操作方便、洗脱条件温和、重复性好、不需要有机溶剂、样品不易变性和回收率高等优点。该技术主要可用于蛋白质的纯化，分子量及其分布范围测定，样品脱盐以及更换蛋白质缓冲液等。采用凝胶过滤层析可将不同分子大小的样品分离开来，这主要归因于固定相基质——凝胶。凝胶是一种具有三维多空网状结构的珠状颗粒物，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。用它作为填充料制成层析柱，可以根据被分离物质的大小进行分离。已有不同型号的葡聚糖凝胶用于不同物质的分离。当流动相中的蛋白质混合样品在凝胶颗粒间流动时，比凝胶颗粒孔径大的蛋白质分子不能进入凝胶网格内，被排阻在凝胶颗粒的外部；比凝胶颗粒孔径小的蛋白质则进入网格内部，小分子蛋白质的下移速度落后于大分子的蛋白质，从而使样品中分子大的蛋白质先流出层析柱，中等分子的蛋白质分子滞后，小分子量的蛋白质分子最后流出，以达到分离效果。金属硫蛋白的提取与纯化4图1-3凝胶过滤层析原理示意图在实际工作中，应用较广的凝胶介质是天然琼脂糖凝胶和人工合成的交联葡聚糖凝胶，前者的商品名为Sepharose，后者为Sephadex。下表为葡聚糖凝胶(G)类的技术数据。表1.1葡聚糖凝胶(G)类的技术参数一般的凝胶层析可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15。除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。2.离子交换层析（Ion-exchangeChromatography，IEC）离子交换层析是发展最早的层析技术之一。所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种靠静电力结合在惰性载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。若惰性载体上以共价键结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，叫阴离子交换剂；若以共价键结合带着负电荷的活性基团，则可交换阳离子，叫阳离子交换剂。在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合；能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合力的大小也不一定相同，所以采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。表1.2离子交换剂的类型与特点交换剂名称（纤维素）作用基团特点金属硫蛋白的提取与纯化5阴离子交换剂二乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H氨乙基AE+-O-C2H4-NH2胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基CM—-O-CH2-COO—最常用在pH4以上磷酸P－-O-PO2－用于低pH磺甲基SM－-O-CH2-SO3－磺乙基SE－–O-C2H4-SO3－强酸性用于极低pH3.亲和层析法纯化重组蛋白（AffinityChromatography）在真核基因的原核表达过程中，为了方便蛋白产物的纯化和检测，用于蛋白表达的载体在启动子与多克隆位点之间通常设计有一段编码特定蛋白或多肽的序列，这样可以得到含有担体蛋白(标签)和目的蛋白的融合蛋白。通常是利用生物体中高效表达的基因或其部分序列为担体(Carrier)序列，将目的基因嵌合在它的下游，随着担体序列的高度表达目的基因也得到高效表达，常用的担体蛋白(标签)有GST、MBP(maltose-bindingprotein)、6×His等[4]。亲合层析法纯化重组蛋白的过程为(以GST融合蛋白为例)：将细胞裂解液与带有Glutathione的琼脂糖珠亲和介质充分混合，GST融合蛋白就会与Glutathione特异性的结合；用适当的缓冲液将未与Glutathione结合的杂蛋白洗掉；用含有还原型的Glutathione洗脱液将GST融合蛋白洗脱下来；将GST融合蛋白产物用适当的蛋白酶(如thrombin)处理得到目的蛋白。图1-4亲合层析法纯化重组蛋白原理1.3.4超滤超滤（UF）也是一个以压力差为推动力的膜分离过程，一般认为超滤是一金属硫蛋白的提取与纯化6种筛孔分离过程。在压差的推动下，原料液中的溶剂和小的溶质粒子从高压的料液侧透过膜到低压侧，所得到的液体一般称为滤出液或透过液，而大的粒子组分被膜截留，使它在滤剩液中浓度增大，达到溶液的净化、分离与浓缩的目的。在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。图1-5超滤原理示意图1.3.5AKTATMPurifier蛋白纯化系统简介AKTAPurifier蛋白纯化系统是一台功能强大的全自动的用于组分分离的精密仪器，可广泛应用于蛋白质纯化研究以及药物开发，支持蛋白质的高纯度、高效率、全自动的纯化。它能实现蛋白样品的分离纯化，并实时精确地检测UV曲线（可检测280/254nm两种波长），以及电导(Conductivity)和pH曲线等。另外，AKTAPurifier还可配自动部分收集系统，可用于样品的自动收集，使层析过程得到了极大地简化和精确化。AKTA工作的平台于软件UNICORN上进行，通过它，可以自由地编写层析的方法程序，实施监测UV，Cond，pH等数据，并对数据进行处理等。金属硫蛋白的提取与纯化72材料与方法2.1主要试剂与工作液的配制2.1.1诱导表达体系1.诱导注射液：称取0.456gCdCl2·2.5H2O(A.R.）、0.176gNaCl(A.R.)用纯水溶解至20mL，在超净台中操作，用以消毒针筒式0.22.um滤器过滤，分装至10只冻存管中（已消毒），每只约600uL，置于4oC保存。2.有机萃取液：取930mL无水乙醇(A.R.)和70mL氯仿，配制成1L乙醇/氯仿（1.05:0.08）溶液，置于-20oC预冷。3.Tris-HCl缓冲体系：称取1.211gTrisBase溶于500mL纯水，用HCl调批pH至8.6，配制成20mMTris-HClbuffer，4oC保存。4.Tris-HCl/NaCl缓冲体系：称取0.606gTrisBase和0.731gNaCl溶于500mL纯水，用HCl调pH到8.6，制成10mMTris-HCl/25mMNaClbuffer，4oC保存。2.1.1分离纯化体系1.分子筛缓冲体系：称取2.422gTrisBase和0.586gNaCl溶于1L纯水，用HCl调pH到8.6，制成20mMTris-HCl/10mMNaCl缓冲液，4oC保存。2.离子交换缓冲体系：缓冲液A：纯水，4oC保存。缓冲液B：称取12.1gTrisBase溶于500mL纯水，用HCl调pH到8.6，制成200mMTris-HCl缓冲液，4oC保存。3.亲和层析缓冲体系：平衡缓冲液：称取8.1816gNaCl、0.2013gKCl、3.5814gNa2HPO4、0.2445gKH2PO4溶于1L纯水，用磷酸调pH到7.3，制成140mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa2HPO4、1.8mMKH2PO4缓冲液，室温保存。洗脱缓冲液：称取0.3029gTrisBase和0.1537greducedglutathione溶于50mL纯水，用NaOH调pH到8.0，制得50mMTris、10mMreducedglutathione缓冲液，现用现配，4oC保存。4.脱盐缓冲体系：平衡缓冲液：将1mL10M的HCl（G.R.）用去离子水稀释到一升，制成10mMHCl缓冲液，室温保存。洗脱缓冲液：称取1.21gTrisBase，溶于20mL纯水，用HCl调pH到金属硫蛋白的提取与纯化88.6，过chelex-100柱去除金属离子后，用去离子水稀释至1L，复调pH到8.6，制得10mMTris-HCl洗脱缓冲液。2.2实验方法2.2.1体内真核表达的提取与纯化1.镉诱导兔肝产生金属硫蛋白买来两只新西兰兔，适应两天，于第三天皮下注射0.1MCdCl2/0.15MNaCl注射液250uL/次，隔天注射，共注射7次。2.兔肝粗提物的制备于最后一次注射的隔天在两只兔子耳静脉打空气针，使其心脏衰竭而死，解剖取出肝脏。剪碎，加入20mMTris-HCl(pH8.6)，用榨汁