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荧光定量PCR技术及其应用荧光定量PCR原理：荧光定量PCR(也称TaqManPCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（PerkinElmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。与普通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点：1、封闭反应，无需PCR后处理。2、特异性强，灵敏度高。3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、定量范围宽，可达到10个数量级。5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在PCR的反应体系中设计一对特异性引物,并在引物3′端的下游再设计一条带有双荧光标记的探针,该探针能与模板DNA发生特异性杂交。探针的5′端标记荧光报告基团FAM(6-羧基荧光素,荧光发射值在518nm),3′端标记荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基丹诺明,荧光发射值在582nm),两者之间构成能量传递。探针的结构完整时,5′-FAM所发出的荧光被3′-TAMRA所吸收或抑制,不出现荧光信号的变化。随着PCR反应的进行，由于Taq酶具有5′到3′外切酶的活性,当合成的新链移动到探针结合的位置S时,Taq酶将探针切断,探针的完整性遭到破坏,能量传递结构亦被破坏,3′TAMRA的淬灭作用被解除,5′FAM的荧光报告基团的荧光信号被释放出来。PCR每复制一个特异的核苷酸片段,就有一个探针被切断,同时一个荧光报告基团被释放出来。产物与荧光信号产生一对一的对应关系,随着产物的增加,荧光信号亦随之增强。在PCR反应过程中检测反应体系中荧光信号连续不断的变化,当信号增强到某一阈值时(根据荧光信号基线的平均值和平均标准差,计算出以99.7%的置信度大于平均值的荧光值,即为阈值),循环次数即循环阈值Ct(cyclethreshold,Ct)被记录下来。该循环参数Ct和PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关系,利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数拟和作图,制成标准曲线,再根据待测样品的Ct值就可以准确的确定起始模板的数量，所以根据PCR反应液的的荧光强度即可计算出初始模板的数量。实时荧光定量PCR原理：在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量PCR技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为CT值（thresholdvalue）。CT值与起始模板的关系研究表明，每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，CT值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量PCR的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。Ct值的确定荧光值的设定：PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺损设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold=10?SDcycle6-15Ct值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值如（图4-6）所示。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。荧光化学:荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光域值（threshold）：PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值是PCR3-15个循环荧光信号标准差的10倍，即threshold=10×Sdcycle6-15。荧光域值设定在PCR扩增的指数期。由于FQ-PCR具有高灵敏性,高特异性和高精确性的特点,目前,该项技术已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析、基因表达、突变及其多态性的研究等多个领域。在水产动物上的应用是运用实时荧光定量PCR技术，研究某一方面对水生生物的生长和内脏中某种物质的mRNA表达丰度的影响。来判断此因素的对水生生物的影响。例如：运用实时荧光定量PCR技术，研究禁食对体质量为（100±1）g的1龄大口黑鲈（Micropterussalmoides）的生长和肝脏中类胰岛素生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA表达丰度的影响。在为期6周的实验期间，对照组每天表观饱食投喂2次；禁食组禁食3周后恢复投喂3周。实验期间对照组鱼体质量和体长逐渐增加。6周后，对照组鱼体增重率为10.99%，体长增加率为3.07%。禁食组禁食3周期间，鱼体质量下降了5.08%、体长减少了1.79%。同时肝组织IGF-ⅠmRNA表达水平呈下降趋势，禁食结束时仅为对照组的29.93%。恢复投喂2周后肝组织IGF-ⅠmRNA的表达量仍显著低于对照组（P0.05），鱼体质量为实验初始水平的98.54%，体长为实验初始水平的99.03%；恢复投喂3周后，禁食组鱼体质量、体长恢复到实验初始时水平（P0.05），但仍与对照组有显著差异（P0.01）；肝组织IGF-ⅠmRNA的表达丰度与对照组无显著性差异（P0.05）。结果显示，禁食使大口黑鲈体质量、体长下降，同时肝组织IGF-ⅠmRNA表达丰度也随之降低；而恢复投饲后，其生长、肝脏IGF-ⅠmRNA的表达丰度也逐渐恢复。研究表明，鱼类的营养状况、生长和与IGF-ⅠmRNA的表达之间存有正相关关系。