全长cDNA主要构建方法的比较

全长cDNA主要构建方法的比较摘要全长cDNA文库的构建是进行功能基因组研究的一种经济、快速、有效的途径,克服了传统cDNA文库的缺点,本文主要介绍了两种较为实用的方法，分别是SMART法和Captrapper法。关键词：全长cDNA构建SMART法Captrapper法随着测序技术和计算机科学的不断发展，大部分生物和人类的基因组全序列测定高速完成。cDNA作为基因克隆的一种重要工具，在帮助人们更好的发现新基因和研究基因功能上发挥了巨大的作用。但是，由于传统的cDNA由于反转录能力差，cDNA酶切位点保护不彻底和非cDNA片段插入导致克隆片段短、无效克隆多和全长率低等缺点,因而无法满足大规模、高通量、高效的功能基因组研究需要。而全长cDNA序列大多数拥有5’和3’端非编码区序列,因而弥补了传统cDNA文库构建方法的缺陷,成为目前基因克隆的一种重要方法。目前主要有CAPture法，Oligocapping法，SMART法，Capjumping法以及Captrapper法。本文主要介绍优点突出的两个方法，SMART法和Captrapper法。SMART方法SMART方法是Chenchik等1996年提出的[3]，该方法利用PowerscriptTMRT反转录酶的反转录、末端转移活性和内切酶sfiⅠ的特性，快速、简单地构建全长cDNA文库。PowerscriptTMRT反转录酶是M-MLVR点突变而来的，丧失了RnaseH的活性，但保留着野生型聚合酶转移酶的活性，能够长距离的反转录，又可识别mR-NA5’帽子结构。原始一链合成中，转移酶的活性低，延伸效率低。用于反转录的5’端poly(A)引物和延伸模板分别含有sfiI（A）、sfiI（B）识别位点的寡聚核苷酸序列。而截短的一链cDNA，反转录酶没有识别到mRNA5’帽子结构，一链cDNA3/端不能被延伸、合成和扩增二链。两端含有sfiI识别位点的全长cDNA，经两种类型（A、B）内切酶sfiI酶切，使两端产生不同的粘性末端，而全长cDNA内部由于sfiI识别位点在基因组中很少见而得以保护，这样就实现了目的全长基因的高效定向克隆。与其他方法相比，此方法有其独特的优点（1）所需起始材料少，一般0.5~1μgmRNA（2）mRNA在合成cDNA前无需任何酶反应或化学反应处理，不会导致处理过程中mRNA的降解和损耗。（3）实验过程快速、简单，整个过程没有对mRNA和中间产物的复杂处理。（4）全长比例较高[13]。SMART方法也有其自身明显的缺点（：1）PCR扩增具有选择性，不利于长片段序列的扩增，使一些长片段的全长基因丢失，不易得到大于3kb片段和低峰度全长基因[13]2）dG加尾效率低，导致文库中基因信息丢失，文库缺乏代表性。在实际应用中，该方法快速、简单的优点使之广受青睐[14~17]，尤其是在医学领域中应用较广[18~20]。4CAP-trapper方法CAP-Trapper方法是由Carninci等提出的[4]，它是根据mRNA5’端及3’端存在一个共同二醇结构来建库。将这种二醇结构氧化后进行生物素修饰,再经过沉淀、酒精洗涤、无RNase的双蒸水重新悬浮等筛选步骤,得到生物素化的mRNA，经反转录酶催化合成cD-NA第一链，接着进行RNaseI处理,未被cDNA保护的mRNA被降解。后经青链霉素磁珠吸附并使用弱碱降解mRNA，得到单链全长cDNA，在末端转移酶的催化下进行5’端Oligo(G)加尾，再进行第二链的合成，定向克隆即可得到全长cDNA文库。为了提高合成全长cDNA的能力和测序效果，该方法进行了改进。一是用海藻糖、山梨糖醇热启动反转录反应。mRNA5’端二级结构阻碍反转录的进行，高温破坏二级结构但同时也抑制反转录酶活性。海藻糖的加入，尤其是再附加山梨糖醇可以保证反转录酶的活性在55~60℃的高温下正常发挥，有利于全长cDNA的合成。二是用Ssth或BsaI、BamHl\Xhol双酶切替换EcolI\Xhol双酶切。EcolI对甲基化不敏感，容易将全长cDNA近端的内部已甲基化的识别位点切割。用对甲基化敏感的限制性内切酶Ssth或BsaI、BamHl等替换EcolI，提高了文库全长比例。三是用SSLM法加尾克服Oligo(G)加尾对测序的干扰[25]，虽然加尾效率（44%）稍抵于Oligo(G)加尾（52%），但该法加尾对片段无选择性，且加尾时无须使用MnCl2和CoCl2，不会造成全长cDNA降解，还利于全长cDNA的转录和表达克隆[26,27]。与其他方法相比，CAP-Trapper方法可以说是一种较好的构建高质量全长文库方法，它兼顾了文库代表性好，全长比例高，建库效率高的优点[13,28]。但也有些缺点（：1）mRNA长期暴露在酶反应体系中，有降解风险（；2）各反应难于控制，所需实验技术高（；3）实验流程长，过程复杂，耗时，费力。由此可见，从这些文库中，研究者们不仅获得了大量有价值的全长序列，对其功能基因组进行深入研究，而且对基因组结构进行了预测。可见，构建高质量的全长cDNA文库会带来一劳永逸的效果。参考文献：董志敏等，全长cDNA文库的构建方法【J】.中国农学通报，2006,22（2）：51-55毛兴国等，几种全长cDNA文库的构建方法【A】。遗传，2006,28（7）:865-873朱利军等，全长cDNA文库构建方法及应用研究【A】。海南大学学报自然科学版，2009，27（2）：185-190CarninciP,KvamC,KitamuraA,etal.HighefficiencyfulllengthcD-NAcloningbybiotinylatedCAPtrapper[J].Genomics,1996,37(3):327~336CarninciP,NishiyamaY,WestoverA.Thermostabilizationandther-moactivationofthermolabileenzumesbythehaloseanditsapplicationforthesynthesisoffulllengthcDNA[J].ProceedingsoftheNationalA-cademyofSciences,1998,95:520~524CarninciP,HayashizakiY.Highefficiencyfull-lengthcDNAcloning[J].MethodsEzymol,1999,303:19~44