山东农业大学学士学位论文

山东农业大学学士学位论文水稻RS6基因反义表达载体的构建及遗传转化1999级生物技术专业苏英华指导教师:张宪省教授李兴国副教授摘要：本实验旨在利用反义RNA技术对水稻种子特异基因RS6进行功能分析。首先以RT-PCR技术克隆到RS6特异片段，然后将此特异片段反向插入表达载体Ubiquitin-1301中，构建起RS6反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6。利用农杆菌介导的方法转化水稻（OryzasativaL.）的胚性愈伤组织。通过抗性筛选，以期获得转基因植株，并通过对转基因植株的表型分析，确定RS6的功能。目前已获得部分抗性愈伤组织。关键词：水稻；反义RNA；表达载体；遗传转化Constructionofexpressionvectorwithanti-RS6andAgrobacterium-mediatedtransformationofrice(OryzasativaL.)Biotechnology,1999YinghuaSuDirectors:XianshengZhangprofessorXingguoLiadjunctprofessorAbstract:ThefunctionofRS6,ageneexpressedpreferentiallyinrice（OryzasativaL.）seedwascharacterizedbyantisenseRNAtechnology.3’UTRofRS6genewasclonedwithRT-PCRandtheantisensesequencewasinsertedintotheUbiquitin-1301expressionvector.ThevectorwithantisensespecificfragmentofRS6wasconstructedandnamedUbiquitin-RS6.TheantisenseconstructofRS6wasthenintroducedintorice(Oryzasativacv.ZhongHua11)callibymeansofanAgrobacterium-mediatedtransformation.Accordingtothephenotypeoftransgenicplants,wecancharacterizeitsbiologicalfunction.Sofar,wehavegotthetransgeniccallisuccessfully.Keywords:OryzasativaL.;antisenseRNA;expressionvector;transformation1山东农业大学学士学位论文1.引言水稻是基因组较小的单子叶植物，也是第一大粮食作物，且已建立成熟的遗传转化系统，是研究禾本科作物以及单子叶植物发育、遗传和分子生物学的模式植物。目前，水稻基因组全序列的测定已经完成，对水稻的分子生物学研究进入了以研究基因功能及其表达调控网络为目的的功能基因组学时代。通过改变基因的表达和调控，可以了解基因的功能。反义核酸技术——根据碱基互补原理，利用人工或生物合成的特异互补的DNA或RNA片段（或其修饰产物）抑制或封闭目的基因的表达[1]——成为研究者经常采用的方法。该类技术主要包括反义寡核苷酸技术、反义RNA技术和RNA干涉技术[1]。反义寡核苷酸技术，即直接应用一段人工合成的寡聚核苷酸，通过碱基配对与细胞内核酸结合，特异地调节基因表达[2]。反义RNA技术将反义RNA转化野生型植株，可以使基因功能丧失，对这类功能缺失突变体直接进行表型分析，是了解基因功能的有效手段。具体做法是利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其离体或体内表达反义RNA[3]。首先，以靶mRNA为模板合成互补配对的一条DNA链，然后以合成的互补DNA为模板合成互补配对的另一条DNA链，此双链DNA片段就是目的基因片段。将目的基因片段反向插入合适的载体中，然后将重组载体导入细胞。当重组载体基因表达时，由于是反向插入，启动子引导的不是目的基因的转录，而是与目的基因配对的反义基因的转录，从而得到反义RNA[4]。反义RNA能与靶mRNA形成较稳定的二聚体，使得靶mRNA易被酶识别而被降解，使蛋白质的表达受到抑制[5]，从而抑制靶基因的表达。RNA干涉（RNAinterference，RNAi）基本原理是外源基因插入受体基因组中的方向不同，导致有义RNA和反义RNA的合成。在生物体内由有义RNA和反义RNA形成双链RNA（dsRNA），形成的dsRNA首先被切割成21-23nt的小分子干扰RNA（siRNA）。然后，siRNA双链结合一个核酶复合物，形成RNA诱导沉默复合物（RISC）。SiRNA在ATP作用下解双链，进而引导RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在特定位置切割，导致基因沉默。在前期的工作中，我们在水稻种子cDNA文库中分离到RS6基因（AF507044）。cDNAmicroarray差异筛选表明，RS6基因在胚中特异表达。Northern杂交结果表明，RS6基因在授粉后10天种子的胚中高水平表达。基因同源性比较显示，RS6与一水稻胚胎特异表达的基因（GI:4097099）具一定的同源性，推测RS6为一新基因，目前该基因的功能还不清楚。本实验采用反义RNA技术，利用单子叶植物强势表达启动子Ubiquitin构建反义表达载体Ubiquitin-1301-RS6，然后进行农杆菌介导的水稻愈伤组织遗传转化。拟通过分析转基因植株的表型，确定RS6基因的生物学功能。2山东农业大学学士学位论文2.实验材料与方法2.1实验材料2.1.1植物材料粳稻（OryzasativaL.sub.japonica）栽培品种中花11由中国农科院提供。2.1.2菌株和质粒大肠杆菌（E.coli）DH5α由植物发育分子实验室保存。根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105由本院崔德才教授惠赠。克隆载体pGEM-TEasy购自Promega公司。双元载体pCAMBIA-1301由中科院上海植物生理研究所提供。2.1.3酶和试剂限制性内切酶（BamHⅠ、KpnⅠ）、T4DNAligase、RNaseA、IPTG、X-gal、DNAMakerDL2000及PCR回收试剂盒（PCRFragmentRecoveryKit）购自宝生物（大连）公司。主要试剂和培养基：TE溶液：10mmol/LTris·Cl（pH8.0），0.1mmol/LEDTA（pH8.0）溶液Ⅰ：50mmol/L蔗糖，25mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1%SDS溶液Ⅲ：5mol/LKAc，冰醋酸LB液体培养基：酵母提取物（5g/L），胰蛋白胨（10g/L），氯化钠（10g/L）LB固体培养基：LB液体培养基，琼脂粉（15g/L）YEP培养基：酵母提取物（10g/L），胰蛋白胨（10g/L），氯化钠（5g/L）N6D2固体培养基：N6培养基，附加2,4-D（2mg/L）（pH5.8）N6大量（20×）50mlN6微量（100×）1000μlVBB1（1.0mg/ml）1000μlVB3（0.5mg/ml）1000μlVB6（0.5mg/ml）1000μl铁盐（200×）5ml蔗糖（30g/L）30g2,4-D（0.2mg/ml）10ml酸水解干酪素1g3山东农业大学学士学位论文Gelrite胶3.5g1000mlN6D2A培养基：N6D2，100μmol/L乙酰丁香酮N6D2CH培养基：N6D2，300mg/L头孢霉素，25mg/L潮霉素N6D2CHS：N6D2CH，30g/L山梨醇MS培养基：MS基本培养基大量元素，微量元素，维生素和铁盐，30g/L蔗糖，3g/LGelrite胶MSR培养基：MS，3mg/L6-BA，0.2mg/LNAA*乙酰丁香酮用二甲基亚砜溶解，过滤除菌后分装于1.5mleppendorf管中。*抗生素应过滤除菌并分装于1.5mleppendorf管中，在培养基灭菌后加入。2.1.4引物PCR引物：RS6-55’TATGGATCCTCGCCGTCGTCTGCTTCT3’RS6-35’TATGGATCCGCGATTATGTACGACT3’表达载体测序引物：VS5’TGCTCTAACCTTGAGTACCT3’2.2实验方法2.2.1反义表达载体的构建水稻为单子叶植物且对潮霉素较敏感，因此选择pCAMBIA系列双元载体作为表达载体。根据已知序列分别设计目的基因RS6的5’端和3’端PCR引物（RS6-5，RS6-3），并在两端加上相应酶切位点（BamHⅠ）。2.2.1.1PCR扩增获得目的片段提取10天种子胚的总RNA，反转录合成cDNA，以此为模板，用引物RS6-5、RS6-3进行PCR扩增反应，体系如下：模板4.0μlRS6-5引物（5μmol/L）4.0μlRS6-3引物（5μmol/L）4.0μlGCBuffer（2×）25.0μldNTP（2.5μmol/L）8.0μlLATaq酶（2.5U）0.5μl4山东农业大学学士学位论文ddH2O4.5μl总体积50.0μlPCR反应条件为：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，56℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，循环数35。2.2.1.2连接将PCR产物与克隆载体pGEMT-Easy连接，体系如下：载体pGEMT-Easy1μlPCR产物3μlT4DNA连接酶1μl2×连接酶Buffer5μl总体积10μl2.2.1.3大肠杆菌感受态细胞的转化（1）准备LB/Ampicillin/IPTG/X-gal固体培养基（含氨苄青霉素100μg/ml，使用前2-3小时涂布浓度为50mg/ml的IPTG溶液和20mg/ml的X-gal各40μl，室温放置，待用）。（2）从-70°C冰柜中取出感受态细胞DH5α，冰浴中融化。在无菌的1.5ml离心中加入2μl连接产物（其中一管加入2μlH2O作为对照）。取50μl感受态细胞与连接产物轻轻混匀，冰浴中放置20分钟。（3）42°C热击90秒，然后立即冰浴2分钟。加入950μlLB液体培养，37°C振荡培养1.5小时（150rpm）。（4）离心1分钟（8,000-10,000rpm），沉淀用100μlLB（不含抗生素）回溶。取适量涂于固体培养基上，37°C倒置培养12-20小时。2.2.1.4重组质粒的筛选与鉴定2.2.1.4.1α互补筛选克隆载体pGEM-TEasy带有LacZ基因，在含有IPTG和X-gal的平板上，可以根据菌落的颜色对转化子作初步的筛选。蓝色菌落为无外源插入片段的空载体，白色菌落即为有外源插入片段的重组子。2.2.1.4.2单菌落的PCR检测用灭菌的牙签从白色单菌落中挑取少量细菌，插入PCR反应液中捻几下，使细菌进入溶液中，随后进行PCR扩增。反应结束后取10μlPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测是否有目的条带。5山东农业大学学士学位论文PCR反应体系如下：菌落\GCBuffer（2×）12.5μldNTP（2.5μmol/L）4.0μlRS6-5引物（5μmol/L）2.0μlRS6-3引物（5μmol/L）2.0μlLATaq酶（2.5U）0.25μlddH2O4.25μl总体积25.0μlPCR反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性1分钟，56℃复性1分钟，72℃延伸1分钟，循环数35。2.2.1.4.3重组质粒插入片段方向的酶切鉴定㈠提取含有插入目的片段的质粒DNA用碱法小量提取质粒DNA。选取已作PCR鉴定的白色克隆RS6单菌落，接种于含10ml液体LB培养基（含氨苄青霉素100μg/ml）的三角瓶中，37℃，培养过夜。具体步骤如下：（1）取约1.5ml菌液置于eppendorf管中，12,000rpm，室温离心1分钟，回收菌体。（2）用1mlSTE缓冲液悬浮菌体沉淀，再离心回收菌体，去尽上清。（3）将沉淀悬浮于100μl冰预冷的溶