共聚焦显微镜原理及应用

激光共聚焦显微镜的原理及应用张毅然31159908激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是目前应用最广泛和光学图像分辨率最高的分子细胞生物学分析仪器，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外光或可见光区激发荧光探针，得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察pH值、钙离子、膜电位等生理信息及细胞形态的变化，是分子细胞生物学研究领域中的新工具。——前言目录LSCM的发展历史LSCM的优势及缺点LSCM的应用LSCM的原理和构造结论与展望1伟大技术被人忽视的那些历史共聚焦显微镜的发明起源于1957年,MinskyMarvin首次在他的专利中阐明了激光扫描共聚焦显微镜技术的某些基本工作原理。1967年,Egger第一次成功地用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。它的成功源自尼普科夫盘的发明和拉曼光谱学理论的建立。LSCM的起源LSCM的发展LSCM的成熟1977年,Wilson在前人研究的基础上,结合构成共聚焦成像的几何学的基础理论，首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。1978年，Brankenhoff等发明了一种有着较高数值孔径的透镜，并将这种高数值孔径的透镜应用在激光共聚焦显微镜上。1987年，White等用免疫荧光标记法使得胚胎的大分子物质成功显示，这标志着LSCM已经成为进行科学研究的重要工具2那些细微技术背后不为人知的原理及结构LSCM用于激发荧光的激光束(Laser)透过入射小孔(lightsourcepinhole)被二向色镜(Dichroicmirror)反射，通过显微物镜(Objectivelens)汇聚后入射于待观察的标本(specimen)内部焦点(focalpoint)处。激光照射所产生的荧光(fluorescencelight)和少量反射激光一起，被物镜重新收集后送往二向色镜。其中携带图像信息的荧光由于波长比较长，直接通过二向色镜并透过出射小孔(Detectionpinhole)到达光电探测器(Detector)（通常是光电倍增管（PMT）或是雪崩光电二极管（APD）），变成电信号后送入计算机。而由于二向色镜的分光作用，残余的激光则被二向色镜反射，不会被探测到。共聚焦显微镜简化原理图原理及结构LSCM只有焦平面上的点所发出的光才能透过出射小孔；焦平面以外的点所发出的光线在出射小孔平面是离焦的，绝大部分无法通过中心的小孔。因此，焦平面上的观察目标点呈现亮色，而非观察点则作为背景呈现黑色，反差增加，图像清晰。在成像过程中，出射小孔的位置始终与显微物镜的焦点(focalpoint)是一一对应的关系（共轭conjugate）,因而被称为共聚焦（con-focal）显微技术探测针孔的作用示意图原理及结构LSCMLSCM是在传统的光学显微镜基础上加装了激光扫描装置，利用激光扫描束通过针孔形成点光源，在焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔聚集后，被光电倍增管(PMT)探测收集,经过信号处理，输出到计算机上成像。激光器显微成像系统光学成像系统扫描系统计算机系统激发滤光片扫描控制器Z轴X-Y调节共聚焦针孔光电倍增管激光强度计算机存储显示三维构建数据分析LSCM基本结构3那些选择我们应该了解的LSCM的优势抑制图像的模糊、获得清晰的图像LSCM葵科花粉普通荧光显微镜(a)与激光共聚焦荧光显微镜(b)成像的对比。Bar=20μmLSCM的优势可光学切片、三维重建LSCMLSCM可通过马达的载物台对样品沿着Z轴上下移动进行控制调节扫描，使样品能够在Z轴上的不同层面得到连续断层扫描图，即光学切片。它可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学图像投影，从而得到一系列层面信息，即二维图像。种子的激光共聚焦连续光学切片和三维重建图。LSCM的优势可光学切片、三维重建LSCM可以将这些连续的光学切片扫描图,通过LSCM软件进行三维重建,得到其三维立体结构，从而能十分灵活、直观地进行形态学观察,并揭示亚细胞结构的空间关系。种子的三维多视角旋转图中，不仅能看出种子侧面的形状和结构,还增加了三维的观赏性。种子的三维多视角旋转图LSCM的优势可光学切片、三维重建LSCM花粉三维多视角动态图LSCM的优势实时多通道荧光,提供定位和定量分析LSCMLSCM与传统场式显微镜不同，它可以同时获取和显示多标记荧光,能一次观察不同信息,不同结构组分定位及定量分析；并能获得荧光和透射光通道(diascopticlightingchannel,DIC)叠加的图片。荧光与透射光通道的叠加。Bar=100μm、LSCM的优势其他LSCM可做局部光操作共聚焦还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描，只要数值孔径足够，就可以反映物镜的最佳分辨率,且放大后的图像与用高放大率、低数值孔径物镜直接获取的无放大图像效果是一样的。ZOOM功能最大限度发挥物镜分辨率LSCM通过在激光整合器后部引入声光调制滤光片系统，可同时分别控制各个波段激光的照射强度或者同一波段激光在任意时间的照射强度。因此，可对图像上特定的区域进行扫描成像。检测过程快、效果更灵敏、定位更准确LSCM由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。可将很微弱的荧光信号放，只要有信号就能被检测到。不仅可以定位到细胞水平,还可以定位到亚细胞水平和分子水平。LSCM的缺点LSCM主要是常用激光激发谱线较少，激光谱线非常狭窄而且紫外区的激光器非常贵。激光照射的辐射强度过高，对活细胞或组织的杀伤严重。在激光照射下许多荧光染料分子会产生单态氧或自由基等细胞毒素作用。4那些脚步正在和该继续往下走的激光扫描共聚焦显微技术已应用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用。它不仅能观察固定的细胞、组织切片，还可以对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态观察和检测，是研究分子细胞生物学、遗传学、免疫学以及病理学的良好的实验手段和分析工具。LSCM的应用LSCM应用介绍图层处理功能1234组织光学切片LSCM以1个微动步进马达控制载物台的升降，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对活的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切片”，得到各个层面的信息。这种功能也被称为“细胞CT”。细胞物理生物化学测定LSCM可进行低荧光探测、活细胞定量分析和重复极佳的荧光定量分析，从而能对单细胞或细胞群的各种细胞器和功能大分子等细胞特异结构的含量、组份及分布进行定性、定量、定时及定位测定;同时可测定分子扩散、膜电位、氧化-还原状态和配体结合等生化反应变化程度。另外，还可以对细胞的面积、细胞周长、形状因子及细胞内颗粒数等参数进行自动测定。三维图像重建LSCM过薄层光学切片功能，可获得真正意义上的三维数据，经过计算机图像处理及三维重建软件，沿X、Y和Z轴或其他任意角度来观察标本的外形及剖面，得到三维的立体结构。荧光的定量、定位分析激光光束在振镜的控制下,可作XY轴的平面扫描，以获取更清晰的单层面、多通道的细节结构。由于排除了非焦平面的荧光干扰，可应用于细胞中多种荧光定位即共定位研究等。应用介绍荧光光漂泊恢复(FRAP)技术胞间通讯的研究细胞膜流动性测定光活化技术LSCM借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域，造成该区域荧光分子的光淬灭，其周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散，扩散速率可直接进行监测，由此揭示细胞结构和各种变化的机制，用于研究细胞骨架构成、核膜结构和大分子组装等。LSCM可通过专用计算机软件，对细胞膜流动性进行定量和定性分析，在研究膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点、温度反应测定及物种比较等方面有重要作用。LSCM具有光活化测定功能，可以控制探针分解的瞬间光波长和照射时间，从而掌握多种生物活性产物及其他化合物发挥作用的时间和空间，以此研究可形成化合物的许多重要活性物质在细胞增殖、分化等生物代谢过程中的作用。细胞生物学功能LSCM的应用实例LSCMβ-微管蛋白在成熟卵母细胞和早期胚胎中的分布和形态（A）（B）（C）（F）（E）（D）红色:染色体;绿色:β-微管蛋白。A:M2卵母细胞中，β-微管蛋白形成纺锤体(如箭头所示);B:2-细胞胚胎中，β-微管蛋白在每个卵裂球中散在分布;C:4-细胞胚胎中，每个卵裂球中β-微管蛋白散在分布，而在极体中β-微管蛋白在极体的核周围聚集;D:桑椹胚中，卵裂球中β-微管蛋白在核周围聚集;E:囊胚中，有些细胞中β-微管蛋白在核周围聚集，在有些细胞中则散在分布;F:在成熟卵母细胞胞质中，β-微管蛋白参与构成星体微管(如箭头所示)。LSCM的应用实例LSCM橄榄(A)、地中海柏树(B)、百合(C)和萝卜(D)花粉的自发荧光现象的激光扫描共聚焦显微镜观察(刻度为100μm)LSCM的应用实例LSCM心肌细胞钙火花发生与刺激信号发生的相关性结果如图显示了2次连续刺激信号对应的钙火花图像(钙火花图像采集时间由激光扫描共聚焦显微镜自动记录)两次连续刺激对应的电火花现象5那些将来我们应该计划的结论与展望LSCM未来随着现代生物研究仪器设备的不断创新，LSCM已被作为全新科研实验手段和强有力的必备研究工具之一，它具有的高分辨率、高灵敏度和能观察空间结构的独特优点，已在形态学、细胞生物学、遗传学、病理学、分子生物学等诸多领域显示出强大的优势和生命力，为科研工作创造了优越条件。现在随着科学技术的不断进步及发展，共焦显微镜发展至今又产生了新的类型，如针孔阵列盘式激光共聚焦显微镜和双光子共聚焦显微镜。双光子激光扫描显微镜采用的是双光子激发，对材料的光损失较小,在厚材料中容易绕过障碍，对生物组织的穿力强，为活细胞组织长时间的观察提供了可能，但获得的荧光量较低，成像质量也不好，分辨力比激光扫描共聚焦显微镜低，需要我们不断地去改进和研发。Thankyou解开那些生命之谜在于，有梦PPTby张毅然