利用不同的方法筛选与鉴定转化子

利用不同的方法筛选与鉴定转化子院系：生命科学学院专业：生物工程班级：10生物工程一班姓名：周伟竞学号：1014200006摘要本文通过蓝白斑筛选、菌落直接PCR、提质粒进行PCR、酶切鉴定的实验方法，通过α-互补筛选（蓝白斑）从转化子中筛选重组子，由于pET32-CaM5Vector上带有lacZ基因，因此可以通过菌落直接PCR的分子鉴定，可以鉴定细菌中有没有转入外源DNA；然后再挑取单菌落进行培养、提取质粒，通过凝胶电泳观察质粒的大小；最后用限制性内切酶切割大小符合的质粒，电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致。关键词菌落直接PCR提质粒酶切鉴定前言通过本次的一系列实验操作，目的是为了能够筛选出含有pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α，并进行鉴定该转化子。质粒具有稳定可靠和操作简便的优点，若要克隆较小的DNA片段（10kb）且结构简单，则质粒是最好使用的了。因为在实际操作过程中，用重组质粒转化的大肠杆菌DH5α的量少，连接产物没有也不可能在经过分离纯化而获得纯的重组质粒，连接产物中混有载体自连而成的空载体、载体与目的片段连接而成的目的重组质粒和载体与非目的片段连接而成的非目的重组质粒。同时，宿主的转化效率极低，因此，绝大部分宿主是没有被转化的，所以很有必要对转化产物进行筛选与鉴定。二、摘要：利用含有抗性的培养基从转化后代中筛选出转化子。因为不含有pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α是不能再含有抗生素的培养基上生长的，而含有重组质粒的细菌则能够在该培养基上生长，采用Amp抗性筛选，所以就可以筛选出相应的转化子。然后在进行相应的鉴定试验。对少量的转化大肠杆菌菌体进行PCR反应，进行鉴定，再从相应的重组子中提取质粒，进行酶切实验，观察电泳酶切片段的大小是否与预期的一致。从而达到实验的真正的目的。三、实验目的：1.学习DNA重组技术的关键技术步骤。2.把体外的重组的DNA引入宿主细胞中，是具有新的遗传性状，并从中筛选出转化子。3.学习电泳法筛选、鉴定重组质粒的方法，通过筛选分析、鉴定出具有所需重组DNA分子的宿主细胞。四：实验原理：1.通过抗生素抗性从转化后代中筛选出转化子。因为非转化菌没有质粒而缺乏相应的抗生素抗性，所以可将转化产物涂布在含有相应抗生素的培养基上筛选.只有含有相应抗性的抗生素抗性基因才能生长繁殖形成菌落.2.通过菌落直接PCR从转化子中筛选出转基因生物,扩增出特殊目的基因片段,判断所得转化子是否为重组子.但因为PCR技术的高灵敏性,往往会产生假阳性结果.所以有必要进一步进行鉴定.3.从候选重组子中提取质粒,通过凝胶电泳观察质粒的大小,再利用限制性内切酶切割大小符合的质粒.电泳观察酶切片段的大小是否与预期的一致.五：实验材料、试剂：1.筛选出来的转化子（含pET32-CaM5质粒的大肠杆菌DH5α）2PCR仪,恒温摇床,台式高速离心机,恒温水浴锅,琼脂糖凝胶电泳装置,电热恒温培养箱,电泳仪,超净台,微量移液枪,1.5mL离心管。3试剂：①质粒提取试剂：溶液I：50mM葡萄糖，10mMEDTA，25mMTris-HCl（pH8.0），用前加溶菌酶4mg/L；溶液II：NaOH溶液（内含1%SDS）：0.2M；溶液III（pH4.8）:60mL5mol/L醋酸钾，11.5mL冰醋酸，28.5mLH2O；饱和酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）氯仿TE缓冲液（pH8.0）:10mMTris-HCl，1mMEDTA，其中含RNA酶（RNaseA）:20µg/ml醋酸铵（pH7.5～8.0）:7.5mol/L异丙醇；70%乙醇；无水乙醇。②酶切试剂：限制性核酸内切酶：HindⅢ（A↓AGCTT）限制性核酸内切酶缓冲液：10×MBuffer0.5×TBEBuffer1%琼脂糖③PCR反应试剂：1.10xPCRbuffer、rTaq酶2.dNTPmixtures：dATP,dTTP,dGTP,dCTP各2.5mM3.前向引物(10uM)：5’-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3’4.反向引物(10uM)：5’-AGAGCGGCCGCCTTTGCCATCATAACTTTGACAAA-3’5.1.0%琼脂糖凝胶六、实验步骤：㈠转化子的筛选取连接反应转化原液100uL，涂布与筛选培养基上，直至液体被完全吸收。倒置平板于37℃继续培养16个小时，平板所长出的单菌落（为白色的）即为转化子。㈡菌落直接PCR:用无菌牙签分别挑取3个白色单菌落,在编好号码的PCR反应管中的底部分别涂抹,然后在PCR管仲配制50μL反应体系.①PCR反应混合液的配制(50μl)10xPCRbuffer2μldNTPmixture1.6μl前向引物(P1)0.8μl反向引物(P2)0.8μlDNA模板μl（用牙签挑取菌落在PCR管中涂抹rTaq酶0.2μl灭菌蒸馏水14.6μl所有试剂加完后，轻轻混匀，稍离心后即可，为了防止反应混合液蒸发，可添加20μl矿物油覆盖。②PCR仪的参数设置94℃2min94℃30sec35cycles62℃30sec72℃30sec72℃5min③琼脂糖凝胶电泳检测反应结束后，取5μlPCR产品，加入1μl6或10xloadingbuffer，混匀后点样，电泳15min。㈢重组质粒的大小鉴定：①用无菌牙签从平板上挑选PCR反应阳性菌落,与没有检测出特异性条带的假阳性菌落,接种于含Amp50μg/mL的5mLLB液体培养基中,37℃下震荡培养12个小时。②质粒的提取：1.吸取1.4mL菌液至1.5mL离心管中.2.离心(8000rpm,1min),弃去上清液.3.加入150μL溶液Ⅰ,用旋涡振荡器充分悬浮菌体.4.加入200μL溶液Ⅱ,加盖后温和颠倒5~6次,直至透明状.(此步骤在5分钟内完成)5.加入150μL遇冷的溶液Ⅲ,加盖后反复颠倒混匀,直至出现白色絮状沉淀,冰浴5分钟.6.离心(14000rpm,10min,4℃),移取上清液于另一干净离心管中.7.向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异丙醇(25:24:1),振荡后均匀抽提,离心(14000rpm,5min),溶液将出现分层.8.移取上层水相溶液(约450μL)于另一干净离心管,加等体积氯仿,振荡混匀抽提,离心(14000rpm,5min)9.移取上层水相溶液于另一干净离心管,加入1/10体积的醋酸钠(pH5.2)和2倍体积无水乙醇混匀,冰浴30min.10.离心(14000rpm,10min,4℃),倒掉上清液.11.加0.5mL预冷的70%酒精振荡,洗DNA沉淀一次,离心5分钟,倒掉上层清液.12.真空抽干或自然风干沉淀.13.加20μL~30μLTE缓冲液使DNA完全溶解,降解RNA杂质,室温放置10min.用作琼脂糖电泳.14.各取5μL质粒DNA加入1μL6×loadingbuffer混匀,进行点样.15.进行电泳，电泳条件:120V,25min.16.利用核酸蛋白检测仪进行DNA浓度和纯度检测。㈣重组质粒的酶切鉴定：①DNA浓度纯度的测定空白测定：吸取200µl蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定。DNA测定：取质粒DNA1µl至一干净的离心管，加入199µl蒸馏水稀释混匀，所有溶液加入到干净的比色杯中，测定260nm及280nm的光吸收值；计录DNA浓度及OD260/OD280比值。②酶切反应酶切反应液的配制:HindⅢ1μl10×Mbuffer2μlDNA5μlddH2O12μl酶切反应条件：37℃水浴2～3小时。③反应结束后，向反应液中加入2.2μl10×loadingbuffer，混匀以停止酶切反应，所有22.2μl样品均点在同一个点样孔中。电泳条件：120V,45分钟左右。七、实验注意事项：1、PCR反应时：所用的与PＣＲ有关的试剂，只作ＰＣＲ实验使用，而不能挪作他用。操作中所使用的ＰＣＲ管，离心管、吸管头等只能一次性使用。特别注意防止引物受到同一引物扩增的ＤＮＡ的污染。2、质粒的提取时：裂解液要预热，以抑制ＤＮａｓｅ，加速蛋白质变性，促进ＤＮＡ溶解。酚一定要碱平衡。取个上清液时，不应贪多，以防止非核酸类成分干扰。异丙醇、乙醇、ＮａＡＣ、ＫＡＣ等要预冷，以减少ＤＮＡ的降解，促进ＤＮＡ与蛋白质等的分相及ＤＮＡ沉淀。3、酶切时：酶切的ＤＮＡ应具备一定的纯度，其中不能含有迹量的酚、氯仿、ＳＤＳ等。内切酶从－２０℃冰箱中取出后，应放入冰浴中，其他实际加完后最后加。八、实验结果：1：PCR电泳结果2、质粒的提取：3、酶切电泳图：八、实验结果分析：从本次的实验结果图来看，ＰＣＲ的电泳带还是比较清晰的，即从转化子从扩增出相应的目的基因片段，表明利用抗性培养基筛选出一定的转化子了。但是质量的提取与鉴定的实验图来看，电泳带不是很清晰（即比较暗），可能是ＤＮＡ的降解不完全、含有较多的蛋白质杂质等，所以造成所提出来的ＤＮＡ不是很纯。从酶切的电泳图来，没有完全得到pET32-CaM5的6131bp和219bp两个片段，应该是HindⅢ酶没有酶切完全，所以造成此次的实验结果不是很理想。九、实验讨论：通过本次的转化子的筛选与鉴定实验，总的来说还是筛选到了含有转化子的大肠杆菌，并进行了相关的鉴定实验，得到了一定的实验预期结果。还有经过一个学期的基因工程实验操作和老师的悉心指导下，使我对基因工程的了解更加深入，同时掌握了一定的实验操作能力，具有了某种程度的科学研究方法和思维方法。十、参考文献：1、《生物工程上游技术实验手册》田长恩主编。2、《基因工程技术实验指导》钟卫鸿主编3、《基因工程实验技术》彭秀玲,袁汉英编著