制备感受态的技术心得

制备感受态的技术心得1：要注意每次做感受态要摇过也菌，最重要的是在摇菌的过程千万不要被污染。2：其次是摇菌，要菌并不需要按照一定比例接，最重要的是收菌时候的OD600的值。这是极其重要的，也是很容易被大家忽略的问题，一般OD值达到0.42-0.48收菌是最好的。其次是方法：我做的方法是经过分子克隆上的INOUE法我做的有一步和他的不同，而且是提高转化效率的主要关键，就是在最后一步是在菌液里加入０.１Ｍ氯化钙再加入甘油终浓度为百分之１４进行保重，在这里我就不做详细介绍了我最后一步就是用0.1Mcacl2重旋保种,最近我做了连接转化的摸索实验,判定1:将片段和载体共同放入37度水浴1min以上.2:只将片段放入37度水浴1min以上,载体放再冰上,这样连接出来的转化效率比平常要高4-6倍,反映体系中最好是有水,先把水和连接酶,连接buffer加再一块,再把载体和片段放在一块,最后再把两种混合物加再一块.最后还是16度连接.大概6个小时就ok啦哈!这样做出来的连接转化率很高,虽然不知道阳性率有多少!这也是我要下一步做的摸索,估计明天才会有结果.分子生物学产品常见问题分析问题原因解决办法DNA完全没有被内切酶切割1)内切酶失活标准底物检测酶活性2)DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA3)条件不适（试剂、温度）检查反应系统是否最佳4)DNA酶切位点上的碱基被甲基化换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株5)DNA酶切位点上没有甲基化（如DpnI）换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3AI代替DpnI)，重新将质粒转至dcm+dam+菌株中扩增6)DNA位点上存在其它修饰将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证7)DNA不存在该酶识别顺序换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证DNA切割不完全1)内切酶活性下降用5-10倍量过量消化2)内切酶稀释不正确用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶3)DNA不纯，反应条件不佳同上4)内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰同上5)部分DNA溶液粘在管壁上反应前离心数秒6)内切酶溶液粘度大，取样不准将内切酶稀释，增大取样体积7)酶切后DNA粘末端退火电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷8)由于反应溶液、温度、强烈振荡使使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡内切酶变性9)过度稀释使酶活性降低适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏10)反应条件不适使用最佳反应体系11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序加大酶量5-10倍DNA片段数目多于理伦值1)内切酶星状活性检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量2)其它内切酶污染用λDNA作底物检查酶切结果3)底物中含其它DNA杂质电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段酶切后没有观察到DNA片段的存在1)DNA定量错误（如RNA含量较高）用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量2)在酶切反应液中形成非特异的沉淀在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次内切酶保存期内快速失活1)保存温度不合适内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存2)以稀释形式保存稀释酶液不宜长期存放，应一次使用3)贮藏缓冲液不适当使用厂家推荐的贮藏缓冲液4)低蛋白浓度内切酶与500ug/ml的BSA一起保存电泳后DNA片段的带型弥散，不均一1)DNA上结合有蛋白质电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化2)内切酶中含有DNA外切酶减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶酶切后的DNA片段连接效率低1)含磷酸盐的浓度高透析，乙醇沉淀去除磷酸盐2)内切酶失活不全或含有ATP酶延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA3)平末端连接加大T4DNALigase用量4)外切酶污染减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA5)连接缓冲液不合适重新配制连接缓冲液三、DNA分子量标准问题分析：问题原因解决办法带弱或无DNA带1)上样DNA的量不够增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高2)DNA降解避免DNA的核酸酶污染3)DNA走出凝胶减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4)对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度DNA带缺失1)小DNA带走出凝胶减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2)分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度3)DNA变性电泳前请勿高温加热DNA链，以20mMNaClBuffer稀释DNA4)巨大DNA链，凝胶电泳不合适在脉冲电声凝胶电泳上分析DNA带模糊1)DNA降解避免核酸酶污染2)DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量3)所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4)DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐5)有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白6)DNA变性电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA不规则DNA带迁移1)对于λ/HindIII片段COS位点复性电泳前加热DNA65℃加热5-10分钟，然后在冰上冷却5分钟2)电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力3)DNA变性以20mMNaClBuffer稀释DNA，电泳前勿加热以λ/HindIII为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题，解释原因如下：在LambdaDNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDNA片段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。解决以上问题的办法，是在电泳之前，把DNA分子量标准67℃加热约10分钟，然后立即放入冰浴中骤冷，待样品冷却后上样。这样即可解离复性的粘性末端，使电泳过程DNA片段形成正常的带型分布。四、凝胶电泳操作注意事项：1.缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。2.琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。3.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。4.样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。5.电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。6.DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。7.DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。