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华南农业大学实验报告实验项目名称：《兽医微生物》综合实习所属课程名称：《兽医微生物学》学生姓名123学号：20098765489专业年级：09班成绩：一、实验目的(1).巴氏杆菌的培养鉴别与病毒的培养1．掌握营养肉汤、血琼脂平板、麦康凯平板、普通琼脂、三糖铁层琼脂的配置方法。2．细菌的分离培养技术（解剖、病料的采集，从组织中分离细菌、培养细菌、移植细菌、纯化细菌，细菌接种）。3．细菌的鉴定技术（光学显微镜油镜的技术，组织涂片，在组织材料中认识细菌、辨别细菌、生化实验、血清学实验技术及细菌片的涂片、染色、镜检等技术）。4．病毒的鸡胚分离培养技术（鸡胚死活的鉴定、鸡胚的接种、胚液的收集）病毒的血凝试验和血凝抑制试验。5．掌握实验用具的包扎、消毒等。(2).酶联免疫吸附实验检测小猪FMDV抗体水平1.掌握给猪只注射药物和疫苗的方法，掌握从前腔静脉抽取猪血（用于分离血清）。2.掌握血清的分离技术。3.掌握病毒的培养，手集，纯化，浓缩等。4.掌握ELISA反映条件的优化，熟悉掌握酶联免疫吸附实验的原理，具体操作和应用。二、实验原理以及实验要求（1）1.利用细菌的一般生理生化特性进行鉴别。2.酶联免疫吸附试验为一种固相酶免疫测定技术，先将已知抗原或抗体包被于固相载体的表面，与待检样品中的相应抗体或抗原发生反应，再加入酶标记抗体或抗原与免疫复合物结合，最后加入酶的作用底物，根据产物颜色的深浅或测定其A值，可进行定性或定量分析。（2）1．通过本次综合实习全面系统地掌握兽医微生物学的基本技术和细菌检验的基本程序，掌握各种生理生化试验的原理及试验方法，将理论与实践有机统一。2．加强对临床常见病原菌鉴定本领的操作训练。3．熟练掌握微生物实验常用仪器的使用及培养基制备的原则和方法。4．对每一步实验要认真对待，对实验结果应详细记录，仔细分析，以便得出正确的鉴定结论，实习结束后，全面总结并写出实习报告。三、实验内容1．细菌与病毒的分离及诊断2．ELISA实验检测小猪FMDV的抗体水平四、实验材料与设备实验材料1.细菌的分离诊断：(1)无菌注射器、抗凝剂、健康鸡、健康兔、血琼脂基础、锥形瓶、蒸馏水、麦康凯琼脂粉、三糖铁琼脂粉、营养琼脂粉、营养肉汤基础、雏鸡、小白鼠、木板、图钉、剪刀、接种环、接种针、镊子、各种染色液、移液枪、葡萄糖培养管、蔗糖培养管、乳糖培养管、甘醇培养管、靛基质培养管、硫化氢培养管、H2O2、氧化酶试纸、巴氏杆菌标准毒、巴氏杆菌阳性血清、靛基质指示剂、载玻片、显微镜等(2)装有不明病毒的80编号小管一支、9-10日龄鸡胚、打孔器、一次性注射器、剪刀、记号笔、镊子、灭菌乳钵、离心管、空平皿、玻璃沙、空试管几支、西林瓶、青霉素、移液管、锥型瓶、U型96孔微量反应板、蛋架(3)载玻片、接种环、镊子、盖玻片、显微镜（4）实验设备：高压消毒炉、恒温培养箱、离心机、电子天平、冰箱、轻微振荡器2.ELISA实验检测小猪FMDV的抗体水平（1）一次性注射器、不锈钢注射器，口蹄疫疫苗，酒精和棉球。（2）离心管，离心机，微量注射器。（3）FMDV，BHK-21细胞（貂鼠肾细胞），温箱，水浴锅，透析袋，PEG20000.生理盐水。（4）酶联检测仪，酶标版，病毒，洗涤液，封闭液，待检测血清，阴性血清，阳性血清，酶标二抗，底物液，终止液。五、实验方法和步骤（一）细菌的的分离及诊断1．实验前准备（此步分量为一组6个人）（1）小鼠的攻毒：挑选健康的小鼠，术者在做好接种准备之后，先用右手抓住鼠尾，令其前爪抓住饲料罐的铁丝网，然后用左手的拇指和食指捏紧头颈部皮肤，并反转左后使小鼠腹部朝上，将其尾巴夹在左手掌与小指之间，右手消毒小鼠大腿根部，把持注射器，以针头插入大腿，注入约0.2.攻毒后，每天观察一次，将病死的小鼠放入冰箱冷藏以备实验。（2）心脏采血：兔心脏采血：触摸健康兔左前肢以下、胸骨以上、靠左的位置，通过心跳感觉心脏位置，用碘酒、酒精棉球消毒，用无菌注射器抽取1ml抗凝剂，并润湿注射器，待酒精干后，将针插入，边插边回抽，当有血冲上针筒时，即抽取血9ml，用作血平板。鸡心脏采血：将无菌注射器抽取1mL抗凝剂，并湿润注射器。触摸健康鸡左翼以下、胸骨以上、嗉囊靠左的位置，通过心跳感觉心脏位置，用碘酒、酒精棉球消毒，待酒精干后，将针插入，边插边回抽，当有血冲上针筒时，即抽取血7ml，用作血平板。(3）血琼脂平板：称取琼脂基础3.3g，加100ml蒸馏水，加热溶解，倒入锥形瓶，高压灭菌15min，待冷却至50℃，加入5%无菌脱纤维鸡兔血10ml，摇匀，倾注至灭菌平皿。（注意琼脂温度过高，鲜血加入后则成巧克力颜色，温度低，则鲜血易凝不易混合。(4)麦康凯平板：每人取一支，每个约8mL。称取麦康凯琼脂粉14.3g，加600ml蒸馏水，加热溶解，倒入锥形瓶，高压灭菌15min，倾注至灭菌平皿。(5)三糖铁琼脂：称取三糖铁琼脂粉15g，加240ml蒸馏水，加热溶解，分装到试管，每支约10ml，高压灭菌15min，趁热摆斜面，待其凝固。（实验室准备）(6)营养肉汤：称取营养肉汤基础4.4g，加200ml蒸馏水，加热溶解，分装到试管，每支约10ml，高压灭菌15min。（实验室准备）（7）血细胞悬浮液：往无菌离心管注入2mL鸡血，再加入4ml生理盐水，摇匀，放入离心机2000r/s离心10min，然后取出离心管，并用无菌注射器吸去起上清液，重复3次。用移液枪吸取1ml血细胞到100ml无菌玻璃瓶中，再加入99ml生理盐水，冷藏。2．分离培养取一因细菌感染而致死的小鼠，腹部向上固定于木板上，用酒精棉球消毒体表，打开腹腔，暴露肝脏，用剪刀夹一燃烧酒精棉球，在肝脏表面烫之杀死表面杂菌，用灭菌接种环插入烧灼部，将接种环旋转1圈，然后取材划线接种于血琼脂平板上，置37℃温箱培养24h。3．形态与染色小鼠作分离培养后，用灭菌镊子和剪刀取一小块肝脏，作组织涂片，进行瑞氏染色，镜检。观察细菌形态特征。4．肉汤增菌培养观察血琼脂平板上的细菌菌落形态特征，然后用灭菌接种环挑取可疑菌落，涂抹到载玻片上，进行革兰氏染色，镜检。用灭菌接种针环挑取可疑菌落，接种到加有血清的营养肉汤，摇匀，置37℃温箱培养24h。5．生化实验观察肉汤变化情况，用灭菌接种环取肉汤中已纯化细菌，涂抹到载玻片上，进行革兰氏染色，镜检。进行生化试验。(1)用灭菌接种环取肉汤中已纯化细菌，分别在麦康凯平板、营养琼脂上划线(2)用灭菌接种针取肉汤中已纯化细菌，分别在葡萄糖培养管、蔗糖培养管、乳糖培养管、甘醇培养管、靛基质培养管、硫化氢培养管进行穿刺(3)用灭菌接种针取肉汤中已纯化细菌，在三糖铁琼脂上进行划线并穿刺。将所有生化培养管及培养皿，置37℃温箱培养246．观察生化实验结果。往靛基质培养管滴加指示剂，观察变化，其它生化管直接进行观察。（二）病毒的实验诊断1．实验前准备(1)心脏采血：触摸健康鸡左翼以下、胸骨以上、嗉囊靠左的位置，通过心跳感觉心脏位置，用碘酒、酒精棉球消毒，用无菌注射器插入，边插边回抽，当有血冲上针筒时，即抽取鸡血2~3ml，装入密封管中，用于血清得制备；用无菌注射器抽取1ml抗凝剂，并润湿注射器，用同样方法取鸡血9ml，并装入离心管中，用于鸡红细胞的制取。(2)血细胞悬浮液：往无菌离心管注入2~3ml鸡血，再加入4ml生理盐水，摇匀，放入离心机以2000r/s离心10min，然后取出离心管并用无菌注射器吸去其上清液，重复4次。用移液枪吸取1ml血细胞到100ml无菌玻璃瓶中，再加入99ml生理盐水，冷藏。2．病毒病料的采集通过无菌手术，取病鸡的脾脏、肝脏、肺、脑的组织块，将其剪碎后，加入少量玻璃砂研磨，然后加入4ml生理盐水和双抗各0.01ml，用注射器将其注入离心管，以10000r/s进行离心10min。3.接种接种鸡胚，采用绒毛尿囊腔接种，通过照胚检测鸡胚死活，在气室边缘避开胚体和血管处作一记号，作为接种的部位，碘酒、酒精消毒，并用打孔器在此处打孔；用1ml注射器吸取病毒液0。1ml，注射器沿小孔插入鸡胚约1。5CM，注入病毒液以胶布封孔，置于37。C温箱中直立培养。4.观察已接种鸡胚24小时后观察鸡胚未死亡。5.处理已接种鸡胚接种48小时后观察鸡胚已死，将鸡胚置4。C冷冻过夜。6.收胚收获病毒液。采用无菌手术去气室顶壳，开口直径为整个气室大小，用无菌镊子撕去部分蛋膜，撕破绒毛尿囊膜而不撕破羊膜，用镊子轻轻按住胚胎，用消毒注射器吸取尿囊液，置于西林瓶中，备用。解剖胚胎。7.血凝及血凝抑制试验采用1%红细胞，以及新城疫的血清和禽流感血清，按下表操作。①血细胞凝集试验（HA）（单位：ūl）孔号123456789101112稀释度1：21：41：81：161：321：641：1281：2561：5121：10241：2048对照生理盐水病毒5050505050505050505050505050505050505050505050弃鸡红细胞505050505050505050505050用轻微震荡器震荡1~2min，放入37℃箱中15~30min.判断1个单位血凝价,并配成4个单位病毒溶液.○2血细胞凝集抑制试验（HI）（单位：ūl）孔号123456789101112稀释度1：21：41：81：161：321：641：1281：2561：5121：10241：2048对照生理盐水新城疫血清5050505050505050505050505050505050505050505050弃4单位病毒505050505050505050505050用轻微震荡器震荡1~2min，放入37℃培养箱中15~30min鸡红细胞505050505050505050505050用轻微震荡器震荡1~2min，放入37℃培养箱中15~30min。（三）ELISA1.实验前准备（1）给猪注射口蹄疫疫苗：使用不锈钢注射器，抽取适量的疫苗液与注射器中，根据需要的注射量，进行调整注射器上的戒指，以保证每次注射的量刚好而不过量。注射过程可以不更换针头，因为注射之前要确保猪只没有患传染病或没发病。有需要的可以每次都用酒精棉球消毒。注射选择耳后的颈部或者臀部肌肉丰满处。注射时等猪只安静并迅速走近并且同时推射，把药物注入体内。（2）抽猪血：抽取血液时注射器不加入抗凝剂（因为抗凝剂是避免细胞受损，而分离血清需要破坏细胞），从猪的锁骨两侧锁骨窝45度角插入注射器，回抽有血时即可抽取。2.分离血清3抗原的制备（1）病毒的增殖与收获，将适量FMDV接种于已长满单层BHK-21细胞的细胞培养瓶中，置于37度培养箱中至细胞完全发生病变后，反复冻融3次，收集病毒。（2）病毒的纯化与浓缩：﹤1﹥将收集的病毒液与75度水浴中作用15min，期间摇动3-4次，以灭活病毒；﹤2﹥灭活的病毒液装入离心管，于1200rpm离心30min。收集上清液；﹤3﹥将透析液置于生理盐水中煮沸5min，然后将纯化的病毒液装入透析袋，放入盛有聚乙二醇2000（PEG20000）的容器中，以吸附病毒液中液体，浓缩至透析袋中的液体体积为原液的1/2即可。4ELISA反应条件的优化（1）抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释倍数的选择：将抗原以1：10，1：20，1：30……,1:1024横向包被酶标版，每个浓度包被8孔，封闭后，将阴性血清和阳性血清以1：10，1：20，1：40……,1:1024纵向加入酶标版，每孔加12孔，最后测定每孔的OD值，以p/N值最大时的抗原浓度为抗原的最佳包被浓度，以此时的血清的稀释倍数为血清的最佳稀释倍数。（2）封闭液浓度的选择：用洗涤液配置分别为含0.1%，0.5%，1%BSA浓度封闭液，按照常规程序进行ELISA实验，以空白对照无色，且P/N值最大时的BSA浓度为最佳的封闭液浓度，结果为0.5%。（3）酶标抗体最佳选择浓度：将酶标抗体用封闭液稀释成不同浓度，如1：1000，1：2500，1：5000，1：10000，按照常规程序进行ELISA实验，以P/N值最大时的稀释倍数所对应的酶标抗体浓度为最佳浓度，结果为1：5000.5ELISA检测12345678包被将抗原