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-1-伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程编制人：年月日审核人：年月日批准人：年月日-2-目录一、目的：伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程的方法和程序。二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》四、责任者：生产车间、质管部。五、正文：Ⅰ工艺流程及质量控制要点Ⅱ操作细则1、制苗材料的制备2、生产用种毒的制备3、半成品的配制4、配苗5、疫苗的分装6、疫苗的冻干7、轧盖贴标8、包装Ⅲ成品检验Ⅳ工艺卫生与人员卫生Ⅴ生产设备一览表Ⅵ包装机检查方法Ⅶ物料平衡Ⅷ劳动定员及劳动保护-3-吉林和元生物工程有限公司GMP管理文件题目伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）生产工艺规程编码：SOP-SC--共13页制定审核批准制定日期审核日期批准日期颁发部门办公室颁发数量生效日期分发单位办公室、生产技术部、质管部一、目的：规定制造伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的方法和程序。二、适用范围：适用于伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）的生产的全过程三、依据：《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）制造及检验试行规程》四、责任者：生产车间、质管部。五、正文：【品名】伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）【质量标准】本企业《伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量标准》【外观】本品为淡黄色海绵状疏松团块，易与瓶壁脱离，加稀释液后迅速溶解。【规格】10头份/瓶、20头份/瓶、70头份/瓶【储藏】在-15℃以下，有效期暂定为18个月【作用与用途】用于高致病性猪繁殖与呼吸综合征。免疫期为4个月。【用法与用量】1按瓶签注明的头份加生理盐水稀释，耳根后部肌肉注射。2仔猪断奶前免疫1次，1头份/头。3母猪配种前免疫1次，1头份/头。【成品代码】C【批量】40000瓶-4-I工艺流程及质量控制要点接种半成品检验种毒制备轧盖贴标包装入待检库成品检验不合格入报废品库销售无害化处理合格入成品库鸡胚成纤维细胞制及检验备旋转培养收获不合格合格无害化处理分装冻干配苗-5-伪狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）质量控制要点工序质量控制要点质量控制项目频次毒种制备种毒无菌检验每批病毒含量每批细胞制备消化时间、温度每批细胞外源病毒检验每批毒液制备接种接种量每批观察细胞再生状况每批半成品检验无菌检验每批病毒含量每批配苗半成品、保护剂无菌检验每批配苗比例每批分装分装过程无菌检验分装过程中前、中、后检验分装量间隔半小时标定分装量冻干冻干曲线共融点、真空度每批成品检验成品理化指标每批无菌检验每批鉴别检验每批效力检验每批安全检验每批外源病毒检验每批支原体检验每批II操作细则本品系用伪狂犬病病毒弱毒株接种于鸡胚成纤维细胞收获感染病毒液，加适宜稳定剂，经冷冻干燥制成，用于预防猪、牛及绵羊伪狂犬病。-6-1制苗材料的制备1.1条件准备1.1.1根据细胞制备所需物品及设备条件，进行全面准备。1.1.2按使用时间，提前做好灭菌工作后将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。1.1.3在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。1.2操作规则1.2.1细胞的制备1.2.1.1制苗用细胞的来源发育良好的9～10日龄SPF鸡胚。1.2.1.2细胞制备选择9～10日龄发育良好的SPF鸡胚，先用碘酒棉消毒蛋壳气室部位，无菌取出鸡胚，去头、四肢和内脏，放入灭菌的玻璃器皿中，用汉克氏液洗涤胚体，用灭菌剪刀剪成米粒大小的组织块，再用汉克氏液洗涤2～3次，然后加0.25%胰酶溶液（每胚4ml），37.5～38.5℃消化20～30分钟，吸出胰酶溶液，用汉克氏液洗涤2～3次再加入适量的营养液（用含5%～10%犊牛血清乳汉液，加适宜的抗生素适量）吹打，用4～6层纱布过滤，制成每1ml含活细胞数约100～150万的细胞悬液，分装于培养瓶中进行培养，形成单层后备用。细胞培养物应无细菌、霉菌（见《无菌（纯粹）检验标准操作规程》）和支原体（见《支原体检验标准操作规程》）污染，无特异性病变。将细胞冻融液接种Marc-145细胞，应不出现任何病变（见《外源病毒检测标准操作规程》）。1.3清场和记录1.3.1工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。1.3.2全面填写《生产工序记录》。2生产用毒种的制备2.1条件准备2.1.1根据毒种制备所需物料及设备条件，进行全面准备。2.1.2按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。2.1.3在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。-7-2.2操作规则2.2.1制苗用病毒液的制备2.2.2.1细胞单层培养将扩大培养的种子细胞接种到转瓶中培养，控制转速9~12转/小时。2.2.1.2接种取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长液，按2％（V/V）接种病毒，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37°C旋转（9~12转/小时）培养。2.2.1.3收获在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变（CPE），直至CPE达到70%以上收获细胞培养物，反复冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40°C以下。2.2.2毒种鉴定2.2.2.1弱毒标准2.2.2.2病毒含量将毒种用无血清培养基做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1mL，设置正常的细胞对找孔，放置5%CO2，37℃下培养观察3~5日，根据Reed-Muench法计算TCID50。病毒含量应≥107.0TCID50。2.2.2.3鉴别检验中和试验：将毒种用无血清培养基稀释成103TCID50/mL，取0.1mL与等量呼吸综合征病毒特异性阳性血清混合，同时设病毒对照组和正常细胞对照组，37℃作用1小时后，接种Marc-145细胞培养板，观察5日。应不产生细胞病变（CPE）。1.2.2.2病毒基因鉴定应用下列引物进行RT-PCR检测，毒种可扩增出581bp的特异性条带，以而猪繁殖与呼吸综合征病毒NVDC-JXA1-R株为代表的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒以及其他猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸为阴性（猪繁殖与呼吸综合征病毒JXA1-R株RT-PCR检测方法见附注3）。U1ATTTGAATGTTCGCACGGTCTCD2CGGAACCATCAAGCACAACTCT2.2.2.4毒力对仔猪的毒力用JXA1-R-R株毒种（≥106.0TCID50/mL）接种4~6周龄抗原猪繁殖与呼吸综合征病毒、抗体阴性仔猪（阴性猪标准见附注1）5头，每头颈部肌肉注射2mL，同时设5头阴性猪作对照，隔离饲养。接种猪逐日测量体温，观察临床症状，均不发病（发病猪判定标准见附注2）。对妊娠母猪的毒力用JXA1-R-R株毒种（≥106.0TCID50/mL）接种怀孕80~90天的母猪3头，每头颈部肌肉注射2mL，同时设同期怀孕母猪3头做对照，隔离饲养，观察母猪临床症状和分娩产仔状况。怀孕母猪应不发生流产，所产仔猪的存活率与未接种对照组无统计学差异。-8-2.2.2.5免疫原性取4~6周龄猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）10头，其中5头肌肉注射JXA1-R-R株毒种2mL（105.0TCID50/mL），另5头作为对照，同条件下隔离饲养。28日后，所有猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXA1株病毒培养液（病毒含量≥104.5TCID50/mL）3mL，每天测温并观察21日。对照猪均应发病，且至少2头死亡，免疫猪应至少4头保护（发病猪判定标准见附注）。2.2.2.6纯净按现行《中国兽药典》进行检验，应无细菌、霉菌、支原体和外源病毒污染。2.2.3基础种子代数82~90代。2.2.4种毒保存-70℃下，保存期暂定为12个月。2.2.5强毒标准2.2.5.1病毒含量将毒种用无血清培养基做10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5、10-64个稀释度，分别接种于96孔细胞板，每个稀释度接种6孔，每孔0.1mL，在37℃下培养观察5~7日，根据Reed-Muench法计算TCID50。病毒含量应≥105.5TCID50/mL。2.2.5.2对猪的毒力取8~10周龄的猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原抗体阴性猪（阴性猪标准见附注1）5头，每头猪肌肉注射检验用强毒NVDC-JXA1-R（104.5~5.0TCID50/mL）3mL，每天测温并观察21日。猪均应发病，且至少2头死亡。1.3.3毒种代次5～6代。2.2.6毒种保存在-70℃以下，保存期暂定为12个月。3细胞系病毒培养用细胞为Marc-145，由中国动物疫病预防控制中心鉴定、保管和供应。3.1细胞标准3.1.1细胞形态用含8％犊牛血清的DMEM细胞培养液，37℃、5％CO2培养2h即可贴壁，24h内可长成单层。显微镜下，细胞呈三角形、多角形、圆形等多种形态。3.1.2外源病毒检验3.1.2.1致细胞病变病毒检验取2个细胞单层，每个单层至少6cm2，培养7天，每日观察细胞，应无细胞病变。3.1.2.2血吸附病毒检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无红细胞吸附现象。3.1.2.3其它特定病毒的检验采用PCR或RT-PCR方法检测，应无BVDV、PCV、CSFV、PPV、PRV和JEV污染。3.1.3胞核学检查对不同传代水平的细胞，取50个处于有丝分裂中期的细胞进行检查。在基础细胞库细胞中存在的染色体标志，在最高代次细胞中也应存在。与基础细胞库的细胞相比，所有细胞的染色体模式数不得高出15%。核型必须相同。-9-3.1.4致瘤性检验用无胸腺小鼠至少10只，各皮下或肌肉注射107个待检细胞，同时用Hela细胞皮下或肌肉注射无胸腺小鼠，每只106个细胞，作为阳性对照，用鸡胚成纤维细胞作为阴性对照。观察21日，Marc-145细胞应无肿瘤形成，阳性对照组应出现明显的肿瘤，阴性对照组应为阴性。3.1.5无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。3.1.6支原体检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无支原体生长。3.2细胞代次基础细胞应为1~10代，工作细胞代次应为10~25代，生产用细胞应在40代以内。3.3保存液氮保存。保存期36个月。4疫苗制造及半成品检验4.1生产用毒种制备4.1.1毒种繁殖将已长成单层的Marc-145细胞倒去生长液，换以含2％毒种的细胞维持液，置37℃下培养2~3天，当70％以上细胞出现病变时收获，置-40℃冻融1次，离心后分装，然后进行鉴定。4.1.2毒种鉴定按1.2.1、1.2.2、1.2.5项进行，应符合规定。符合上述标准的毒种作为生产用毒种。4.1.3毒种保存在-70℃下保存，应不超过12个月。4.1.4毒种继代应不超过3代。4.2清场和记录4.2.1工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进行处理。4.2.2全面填写《生产记录》。5半成品的制备5.1条件准备5.1.1根据毒液繁殖所需物料及设备条件，进行全面准备。5.1.2按使用时间，将准备好的各种物品提前移入洁净工作间待用。5.1.3在工作开始前30～40min，按净化级别要求调整送风量，达到洁净级别要求。5.2操作规则5.2.1接种取所需数量的、细胞覆盖率达到80%以上的细胞转瓶，弃去生长液，按2％（V/V）接种病毒，加入含2%胎牛血清的细胞培养液，37°C旋转（9~12转/小时）培养。-10-5.2.2收获在显微镜下观察由病毒引起的细胞病变（CPE），直至CPE达到70%以上收获细胞培养物，反复冻融1次，经离心或过滤除去细胞碎片，冻存于-40°C以下。5.3半成品检验5.3.1病毒含量取病毒液按1.2.1项进行检验，病毒含量应≥107.0TCID50/mL。5.3.2无菌检验按现行《中国兽药典》进行检验，应无菌生长。5.4清场和记录5.4.1工作结束后，应全面清场，对工作间、所用器具、玻璃器皿、物料及废弃物等应按规定分别进