木质素降解微生物特性及其对农业废物堆肥腐殖化的影响研究

湖南大学博士学位论文木质素降解微生物特性及其对农业废物堆肥腐殖化的影响研究姓名：黄红丽申请学位级别：博士专业：环境工程指导教师：曾光明;黄国和20090315木质素降解微生物特性及其对农业废物堆肥腐殖化的影响研究作者：黄红丽学位授予单位：湖南大学相似文献(10条)1.学位论文郁红艳农业废物堆肥化中木质素的降解及其微生物特性研究2007木质素是农业废物堆肥化过程中的主要限速有机物，其降解被认为是快速堆肥的关键。本文系统研究了农业废物堆肥化中木质素的降解过程及其微生物特性，首先分别运用传统方法、Biolog法、PLFA法、醌指纹法研究木质素降解微生物群落演替规律，其次筛选高效优势的木质素降解微生物，并研究非白腐真菌简青霉(P.simplicissimum)、黑曲霉(A.niger)的木质素降解特性和降解机理，最后研究一株高效优势的木质素降解放线菌栗褐链霉菌对腐殖质产生的作用。传统方法研究发现，木质素降解主要发生在高温期和二次发酵期。多酚氧化酶PPO和过氧化物酶POD是木质素降解的主要酶系，其中PPO的催化氧化作用较强。木质素降解细菌、放线菌、真菌在堆肥化各阶段变化复杂，其中，放线菌是主要的木质素降解者，从整个过程看，各类群微生物对木质素降解的贡献为放线菌真菌细菌。细菌群落在堆肥化进程中木质素的生物降解方面起着重要的协作作用。应用Biolog法检测堆肥化过程中细菌群落沿替，并通过多元统计分析，发现堆肥初期细菌生长快速、群落丰富，随着堆制的进行，其平均活性逐渐下降。细菌群落结构在一次发酵期间发生着剧烈变化，二次发酵期间趋于稳定。能转化BiologGN2板上第一、二、四类碳源的细菌与木质纤维素的转化有关，其中第一、二类碳源表征农业废物堆肥化进程中的主要细菌种群，第四类碳源表征细菌能够耐受高温。应用PLFA-PLS法构建了木质素含量与PLFA之间的定量回归模型，分析模型参数可发现，农业废物堆肥化过程中木质素的有效降解是数量少、能力强与数量多、能力弱的微生物共同作用的结果，前者主要是真菌、放线菌，后者主要是细菌，其中真菌与放线菌在堆肥化过程中占主导地位。微生物种类较之数量对于木质素降解更为有利。在高温期，有效的木质素降解微生物群落组成为：革兰氏阳性细菌/革兰氏阴性细菌/放线菌/真菌=42/35/6/17；在二次发酵期为：革兰氏阳性细菌/革兰氏阴性细菌/放线菌/真菌=58/23/4/15。微生物浓度数量级为10'8cells/gdw。醌指纹法证实堆肥化过程中发生着剧烈的群落演替，且微生物群落结构随着堆肥成熟逐步趋于复杂。MK-7指示的细菌和Q-9指示的真菌在堆肥化初期为优势菌群，主要降解易降解有机物，与木质纤维素降解无关。部分饱和、长链的甲基萘醌指示的放线菌是高温期优势微生物，这类微生物是木质素降解的主要作用者。放线菌、真菌和小部分细菌在二次发酵期间共同协作，对木质素降解有一定作用。Q-9与Q-10(H2)指示的微生物是纤维素与半纤维素降解的主要微生物，而木质素的有效降解是一些还未被广泛认识的含Q-9(H2)为主要醌的微生物与高温放线菌共同协作的结果。筛选到几株较强的木质素降解菌，包括AspergillusnigerF4-1，AspergillusoryzaeF1-4、PenicilliumsimplicissimumF1-1、StreptomycesbadiusA4-2以及高温放线菌Thermoactinomycessp.A2-2。对黑曲霉的研究发现该菌能攻击木质素酚型、非酚型结构和苯环侧链结构。在实验条件下，该菌主要依靠胞外LiP、Lac、MnP共同作用降解木质素，并表现出次级代谢降解机制。简青霉具有较强的攻击木质素酚型结构的能力，降解木质素主要依靠胞外Lac，表现出明显的初级代谢机制。pH值对降解系统有较大的影响，Mn'2+不利于降解，而Cu'2+对木质素降解有较强的促进作用。对简青霉产酶调控机理研究发现，附加碳源抑制漆酶Lac活性，适量氮源可显著提高酶活，常用的Lac诱导剂ABTS和二甲苯胺并不能促进简青霉产生Lac。在发酵过程中，前期Lac主要起聚合作用，而后期可能在某些降解产物的协同作用下，Lac表现出较好的降解能力。各种附加营养条件诱使简青霉在第3d出现Lac活性峰，该峰值下漆酶聚合能力特别强，直接影响最后木质素的降解率。比较黄孢原毛平革菌和栗褐链霉菌对腐殖质形成的作用，结果表明，接种木质素降解菌能促进发酵体系中腐殖质的形成，栗褐链霉菌的促进作用更强。由于黄孢原毛平革菌和栗褐链霉菌具有不同的木质素降解机制，它们分别形成腐殖质的途径也不同。黄孢原毛平革菌转化木质素生成简单分子(FA)，然后聚合FA生成复杂的分子(HA)，而栗褐链霉菌改性木质素，先生成HA，然后将HA转化成FA。2.学位论文王毅农林废物堆肥化中细菌对木质素的降解及产酶研究2008随着经济的发展，农业废物的排放也在急剧增加。作为农业废物资源化利用技术之一的堆肥化处理技术进入了科学化的新阶段。为了改善该技术存在的如历时时间长，肥效低等诸多不足，提高堆肥效率、提升产品质量，使之能大规模推广应用，国内外研究者开展了大量研究工作。其中，限速有机物的降解一直被认为是快速堆肥的关键，农业废物堆肥化中的限速有机物主要是指木质纤维素，这类有机物结构坚硬，分解困难，与腐殖质产生有密切联系，尤其是木质素，最难攻击且难以分离，其降解被认为是快速堆肥的关键。本文系统阐述了农业废物堆肥化中木质纤维素的降解及其微生物特性，运用传统方法筛选出高效优势的木质素降解细菌，并研究了细菌对木质纤维素的降解特性和初步的降解机理。从农林废物堆肥中分离得到一株细菌经鉴定为枯草芽孢杆菌，将该细菌用于木质素类化合物利用，固态培养条件下考察其对木质纤维素的降解能力及产酶特性，另外对发酵前后的稻草结构进行了红外光谱分析。结果表明，枯草芽孢杆菌具有木质素降解能力，兼具低分子量木质素酚型、非酚型类物质的降解能力。其对木质素降解是木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和半纤维素酶共同作用的结果。在本实验条件下，培养30d使木质素降解率达9.47％，同时对纤维素、半纤维素也有较高程度的降解；降解率分别为38.8％、41.84％。红外光谱分析结果表明，稻草木质素结构被破坏，枯草芽孢杆菌对木质素各官能团的降解作用有所不同。3.学位论文冯冲凌黄孢原毛平革菌及其在堆肥中对木质素生物降解特性的影响研究2007随着社会的发展，大量固体废物的数量急剧增加。如何有效的将大量固体废物减量化、资源化已经成为目前世界各国十分关注的课题。堆肥化是将固体废弃物变废为宝的有效方法，但是由于传统的堆肥方法堆置周期长，堆肥肥效差，因此有效提高堆肥处理技术也成为近年来国内外学者研究的热点。固体废物（尤其是农业废物）中往往含有大量木质纤维素，而其中木质素作为堆肥过程中难降解的大分子物质之一可被某些微生物利用并最终转化成为腐殖质，它是植物营养的储存库，也是土壤肥力的基础。因此堆肥中木质素的降解与转化成为缩短堆肥时间的限制环节和提高堆肥品质的关键环节。白腐菌通过特殊的降解酶系可以有效降解木质素，因此本课题对白腐菌的典型菌—黄孢原毛平革菌产酶体系以及其降解天然木质素的特性进行了研究，并且最终将其应用到堆肥中研究其在堆肥过程中对木质素生物降解特性的影响。本课题首先对黄孢原毛平革菌产酶体系进行了研究，在液态培养条件下，通过正交实验得出了本实验条件下黄孢原毛平革菌产酶的最佳条件，实验结果表明，在复合碳源体系下，微量的芳香化合物可以有效促进该菌的产酶，复合碳源体系中不同结构碳源的配比也能显著影响该菌的产酶。其次，采用固态发酵方法研究了黄孢原毛平革菌对木质素的降解作用，研究发现该菌所产木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶(MnP)活性高时，则木质素降解程度也高，通过紫外光谱分析的结果表明，经该菌降解后，稻草中的木质素结构被严重破坏，难降解的大分子长键烃被切断成易降解的小分子短键烃，从而使木质素被有效降解。最后，本研究将黄孢原毛平革菌应用于堆肥体系中，通过对堆肥过程中pH、水溶性C/N、木质素含量、纤维素含量、半纤维素含量、有机质含量、腐殖质含量、胡敏酸各级分子量分布变化、富里酸各级分子量分布变化、腐殖质结构各参数的监测发现黄孢原毛平革菌可以加速堆肥的腐熟，成熟堆肥中腐殖质主要是由微生物降解木质素所形成的。实验结果表明，接种了黄孢原毛平革菌的堆料中，木质素的含量和有机质的含量明显低于未接种的堆料，进一步分析腐殖质中胡敏酸、富里酸的各级分子量分布发现，在堆肥过程中，黄孢原毛平革菌降解木质素并非只发生在其次生代谢阶段，在堆肥初期它也可以降解、转化木质素并且从而产生大量易生物降解的小分子物质，这些小分子物质可以被黄孢原毛平革菌和其它土著微生物作为碳源和能源而利用。由于黄孢原毛平革菌同土著微生物协同作用最终导致接种了黄孢原毛平革菌的堆料提早腐熟。此外，还通过对堆腐始末堆料中腐殖质结构的FTIR波谱分析发现黄孢原毛平革菌有利于基质中甲基、亚甲基等基团的降解，而这些基团主要来源于木质素，因此可以说明该菌在堆肥过程中有利于木质素结构的降解。接种黄孢原毛平革菌后腐殖质中脂肪族物质的含量减少，而其芳构化程度有了明显的提高，最终使得堆肥成品的品质也得到了提高。4.学位论文喻曼基于非培养生物技术的堆肥微生物群落研究及木质纤维素降解2009针对堆肥化环境微生物的复杂性以及木质纤维素难降解的特性，本文以农业秸秆为主要原料，采用好氧堆肥，从物理化学、酶学以及基于非培养生物技术的微生物群落结构演替等方面较系统地研究了接种黄孢原毛平革菌对堆肥发酵进程和木质纤维素降解的影响；并综合运用多种非培养生物研究方法与数学统计方法系统地研究堆肥化过程中微生物群落演替规律；基于上述规律研究其降解机理与特性并从堆肥化各阶段选育高效优势的降解菌株，为堆肥工艺的优化和接种剂的开发提供依据。在稻草固态发酵体系中同时接种土壤微生物和黄孢原毛平革菌，用磷脂脂肪酸(PLFA)谱图分析法研究发酵过程的微生物群落和生物量变化，同时监测木质纤维素降解率的变化。结果表明，复合微生物体系降解木质纤维素的效率明显高于单一菌种的效率。根据标志性脂肪酸的变化，在发酵第6d，革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌的含量都达到了最高值，其中，革兰氏阳性菌的含量较低；真菌和细菌的脂肪酸含量比值变化范围为0.2～0.5，说明真菌是降解木质纤维素的主要群落。主成分分析结果显示发酵后期以18C不饱和脂肪酸为主，与标志性脂肪酸分析结果一致，同时跟木质纤维素降解率的变化趋势对应，因此PLFA分析法可以较好地反映稻草固态发酵过程中的微生物群落结构和生物量的变化。P.chrysosporium对应单体PLFA与木质纤维素相关性分析显示革兰氏阳性菌和真菌在降解木质素上具有相同的效率，P.chrysosporium是降解木质素的主要真菌。用RFLP方法和酶活检测方法研究了在农业废物堆肥一次发酵和二次发酵期间添加黄孢原毛平革菌对微生物多样性和木质纤维素降解酶系的影响。结果表明，在不同发酵期接种P.chrysosporium对堆肥进程的影响不同：(1)三种典型的限制性内切酶AluⅠ、HaeⅢ和TaqⅠ在分析堆肥细菌微生物多样性的灵敏性上，HaeⅢ效果最好，AluⅠ次之，TaqⅠ则不是很适用于分析堆肥细菌微生物多样性。添加的P.chrysosporium对堆肥系统中某些微生物更具有一定的选择作用，使其成为优势物种以促进堆肥物质的降解，多样性有所降低，二次接种能够巩固一次接种效果；(2)接种P.chrysosporium能够促进堆肥体系中的木质纤维素降解，实验结果显示接种P.chrysosporium的堆体中木质素降解率要明显高于未接种的堆体。接种P.chrysosporium对木聚糖酶活和CMC酶活的分泌没有明显影响，对Lip和Mnp酶活产生有促进作用，但是对Lac的产生有一定抑制作用。组合应用了三类非培养生物技术，即PLFA法、RFLP法、DGGE法，分析农业废物堆肥化中微生物群落和多样性的变化。结果表明三类方法显示的信息并不完全一致：(1)