低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡

中国组织工程研究第20卷第14期2016–04–01出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchApril1,2016Vol.20,No.14ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH1989·研究原著·张优，男，1990年生，江苏省徐州市人，汉族，苏州大学在读硕士，主要从事心血管病临床研究。并列第一作者：严卫亚，男，1987年生，江苏省盐城市人，汉族，2015年苏州大学毕业，硕士，主要从事心血管病临床研究。通讯作者：惠杰，教授，博士生导师，苏州大学附属第一医院心内科，江苏省苏州市215000并列通讯作者：杨君杰，博士，副教授，苏州大学心血管病研究所，江苏省苏州市215000中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)14-01989-10稿件接受：2016-02-08，严卫亚2，沈振亚2，杨君杰3，惠杰1(苏州大学附属第一医院，1心内科，2心外科，江苏省苏州市215000；3苏州大学心血管病研究所，江苏省苏州市215000)引用本文：张优，严卫亚，沈振亚，惠杰.低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡[J].中国组织工程研究，2016，20(14):1989-1998.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.14.002ORCID:0000-0002-3721-0971(惠杰)文章快速阅读：文题释义：低氧预处理：低氧预处理能激活细胞内的一些保护机制，增强干细胞的抗凋亡和旁分泌功能，促进干细胞的存活和新生血管形成，从而进一步促进组织修复和功能恢复，提高干细胞移植效果，且无致肿瘤形成风险。Pim-1：最早是作为莫洛尼小鼠白血病病毒的前病毒插入点而被发现，Pim家族还包括另外2个成员，即Pim-2和Pim-3，它们都包含一个被称为ATP锚的活化位点。Pim-1基因产物属于钙离子/钙调素依赖的蛋白激酶，并在多种细胞组织进化过程中高度保守。Pim-1基因在细胞增殖、分化、凋亡等许多生理病理中起重要作用，此外发现其在心肌梗死局部区域表达明显提高，抑制心肌梗死后心肌细胞凋亡及心室重构。摘要背景：骨髓间充质干细胞移植入缺血心肌后存活率低，而低氧有可能增强骨髓间充质干细胞的增殖，促进其存活。目的：探讨Pim-1激酶是否介导缺氧预处理对骨髓间充质干细胞的保护作用及其机制。方法：设置不同低氧处理时间(0，6，12，24h)处理骨髓间充质干细胞，RT-qPCR及Westernblot检测Pim-1及凋亡相关基因的表达，确定最佳低氧处理时间为12h。将骨髓间充质干细胞分为3组：正常对照组、低氧组、低氧+Pim-1抑制剂组，分别进行Transwell迁移实验、细胞凋亡流式检测、线粒体膜电位检测评估各组骨髓间充质干细胞的迁移能力及抗凋亡能力；建立心肌梗死模型，1周后按分组在大鼠梗死心肌周围多点注射骨髓间充质干细胞，2周后制备心肌冰冻切片行DiI染色统计骨髓间充质干细胞存活数量；心肌梗死模型建立前后、细胞移植4周行超声心动图检查评估大鼠心脏功能。结果与结论：①低氧处理12h时，骨髓间充质干细胞的Pim-1、p-Akt及Bcl-2表达量明显升高，Bax、Caspase-3表达量明显降低。②低氧组骨髓间充质干细胞抗凋亡能力明显增强，与正常对照组之间差异有显著性意义(P0.01)。③低氧组骨髓间充质干细胞移植1周后存活率明显提高(P0.001)；移植4周后，大鼠心功能明显改善(P0.05)。上述获益可被Pim-1抑制剂抑制。④结果证实，低氧预处理骨髓间充质干细胞通过激活Akt及上调Pim-1表达抑制细胞凋亡，改善骨髓间充质干细胞对缺血性心脏病的治疗效果。关键词：干细胞；骨髓干细胞；低氧；凋亡；骨髓间充质干细胞；Pim-1；Akt；心肌梗死主题词：骨髓；间质干细胞；细胞低氧；细胞凋亡；心肌梗塞；组织工程低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡Caspase-3张优，等.低氧预处理诱导骨髓间充质干细胞Pim-1激酶高表达抑制细胞凋亡P.O.Box10002,Shenyang110180’sdegree,DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,ChinaYanWei-ya,Master,DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,ChinaZhaogYouandYanWei-yacontributedtoequallythiswork.Correspondingauthor:HuiJie,Professor,Doctoralsupervisor,DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,ChinaCorrespondingauthor:YangJun-jie,M.D.,Associateprofessor,InstituteofCardiovascularDisease,SoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,ChinaHypoxicpreconditioninginhibitsapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsthroughoverexpressingPim-1ZhangYou1,YanWei-ya2,ShenZheng-ya2,YangJun-jie3,HuiJie1(1DepartmentofCardiology,2DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,China;3InstituteofCardiovascularDisease,SoochowUniversity,Suzhou215000,JiangsuProvince,China)AbstractBACKGROUND:Bonemarrowmesenchymalstemcellshavealowsurvivalrateafterimplantedintotheischemicmyocardium.However,hypoxiapreconditioning(HPC)mayenhancebonemarrowmesenchymalstemcellproliferationandpromoteitssurvivalrate.OBJECTIVE:ToexplorewhetherPim-1isinvolvedinHPCprotectingagainstapoptosisofbonemarrowmesenchymalstemcellsandtherelevantmechanism.METHODS:BonemarrowmesenchymalstemcellswererespectivelysubjectedtoHPCfor0,6,12,and24hours.TheexpressionofPim-1andapoptosis-relatedgenesweredetectedbyRT-qPCRandwesternblot.Then,thebesthypoxicpreconditioningtimewasdeterminedas12hours.Then,bonemarrowmesenchymalstemcellswereassignedtooneofthefollowinggroups:control(withoutHPC),12-hourHPC,12-hourHPC+Pim-1inhibitorgroups.Flowcytometryanalysiswasusedtodetectthecellapoptosis,Transwellassaytoanalyzethecellmigrationabilityineachgroup,andJC-1kittodetectmitochondrialmembranepotential.Animalmodelsofmyocardialinfarctionwereestablished.Oneweekaftermodeling,bonemarrowmesenchymalstemcellsweregivenviamulti-pointinjectionaroundtheinfarctzoneofrats.Twoweeksaftermodeling,hearttissuesofratsweretakenandslicedfollowedbyDiIstainingtocalculatethesurvivalrateofbonemarrowmesenchymalstemcells.Additionally,ratcardiacfunctionwasassessedbyechocardiographypriortoandaftermodelingaswellasat4weeksaftercelltransplantation.RESULTSANDCONCLUSION:At12hoursafterHPC,theexpressionofPim-1,p-AktandBcl-2geneintheinfarctregionwassignificantlyincreased,buttheexpressionofcaspase-3andBaxwassignificantlydecreased.Comparedwiththecontrolgroup,cellviabilityinthe12-hourHPCgroupwasincreasedverysignificantlyat1weekaftercelltransplantation(P0.001),themigrationandanti-apoptosisabilitywereenhancedsignificantly(P0.01)andthecardiacfunctionofratswassignificantlyimprovedinthe12-hourHPCgroup(P0.05).AlloftheseprotectiveeffectswereblockedbythePim-1inhibitor.ThesefindingsindicatethatHPCcanprotectbonemarrowmesenchymalstemcellsfromapoptosisthroughactivatingAktandup-regulatingPim-1,an