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体内药物分析整理者：王思雨绪论1.体内药物分析是一门研究生物机体中（药物、代谢物和内源性物质的）质与量变化规律的分析方法学，是药物分析的一个重要分支。2.生物样本包括生物体的各种器官、组织和体液。3.分析对象：母体药物及其代谢产物、必要的内源物质、与之相关的其他药物。4.体内药物分析的任务：分析方法学的研究和完善（首要任务）、体内药物的测定和研究、内源性物质的测定和研究5.体内药物分析的特点：干扰物质多、样品量少、不能重复取样、被测成分浓度低、要求快速提供结果、有一定的仪器设备、工作量大、待测物的易变性。第一章1.选取生物样品的一般原则：能反映药物浓度与药物效应之间的关系、易获得、便于处理，适合于分析、根据不同目的与要求2.血药总浓度（结合型和游离型）3.当药物与血浆蛋白的结合率稳定时，血药总浓度可以有效地表示游离药物浓度样品处理：血浆(plasma)全血+抗凝剂（肝素，等）→2500至3000rpm离心5~10min→上清液血清(serum)全血→放置30min至1h→2500至3000rpm离心5~10min→上清液全血(wholeblood)全血+抗凝剂（肝素等）→混合4.尿液：收集服药后一定时间内（8、12、24h…）尿样，记录体积，混合均匀后取一定量,测定尿中药物浓度，计算一定时间内尿中药物的累计量。尿中药物浓度变化较大，其变化不直接反映血液中药物浓度，因此，两者相关性较差，在药动学、生物利用度研究方面应用较少。用于：药物剂量回收，肾清除率，代谢物类型研究，及人群代谢分型研究。5.唾液：漱口15min后收集口内自然流出或经舌在口内搅动后流出的混合唾液，离心后取上清液。与血浆药浓相比，唾液中药物浓度变化较大，且浓度较低。蛋白含量低，内源性物质少，便于前处理。6.组织器官新药临床前药动学研究（组织分布研究）临床中毒死亡的原因分析、司法鉴定通常需要先制备组织匀浆7.头发：主要用于体内微量元素的分析（发硒）、滥用药物和兴奋剂检测、毒物分析（砷）8.生物样品取样：包括服药前空白血样、在曲线的峰前至少4个点、峰后6个及以上，峰附近应有足够的点，总采样点不少于12个（不包括空白）。取样持续到3-5个半衰期或者血药浓度为Cmax的1/10-1/20。治疗药物浓度监测时，需连续给药，经过5个半衰期，血浓达到稳态后取样。9.样品预处理目的：使药物或代谢物游离，便于测定总浓度；使被测物纯化、浓集；消除干扰；防止对分析仪器的污染。10常用去蛋白的方法：蛋白质沉淀法和组织酶消化法蛋白质沉淀法：生成不溶性盐：酸类（TCA、HClO4等）重金属盐（Zn2+、Cu2+、Ag+）盐析和脱水：中性盐（（NH4）2SO4、NaCl）能与水混溶的有机溶剂（甲醇、乙腈、丙酮）11.缀合物的水解：含有羟基、氨基、羧基、巯基的药物或代谢物分子与葡萄糖醛酸结合成苷，与硫酸形成酯。这些缀合物的极性均较母体大，亲水性强，不易被有机溶剂提取，需进行水解处理。酸水解(简便、快速，但专一性差)酶水解(β-葡萄糖醛酸苷酶、硫酸酯酶)12.有机破坏：有些生物样本需通过有机破坏的方法使被测游离。干法破坏（如高温电阻炉灰化，氧瓶燃烧）湿法破坏13.游离药物分离：平衡透析法（半透膜）超滤法（超滤管）超速离心法14.提取净化：液-液萃取和液-固萃取液-液提取(liquid-liquidextraction,LLE)，选用与水不相混溶的有机溶剂进行提取。溶剂提取的关键问题是：提取选择性和提取率的重复性。提取效率与分配系数及提取溶剂体积有关（生物样本分析中一般只提取1次，提取回收率一般要求50%以上）15.影响提取率的因素（1）水相pH当pH=pKa时,50%药物以非电离形式存在，欲使药物以游离状态存在，则必须调整样本的pH值。（碱性药物pH﹥pKa2~3个单位；酸性药物pH﹤pKa2~3个单位）（2）有机溶剂：要求对未电离部分可溶而对已电离部分不溶；沸点低（易挥干）；与水不混溶，无毒；不易燃烧；不易乳化；具有较高的化学稳定性和惰性；不影响紫外检测。（3）离子强度：在水相中加中性盐，如NaCl，可增加离子强度，使溶液中水分子与无机离子强烈缔合，导致与药物缔合的水分子减少，使药物在水相中溶解度变小，有利于有机溶剂提取16.离子对提取法：被测物Q+与反离子X－形成离子对QX，增强了药物的脂溶性，可被有机溶剂提取。常用反离子：测定碱性药物(阳离子)——采用烷基或芳基的磺酸盐(庚烷磺酸钠等)，无机酸根（ClO4-,Cl-）；测定磺酸、硫酸、羧酸类药物或葡萄糖醛酸苷（阴离子）——采用4~12个C的烷基铵，如四丁基铵等17.提取技术试管内操作，一般提取一次，至多两次。有机溶剂与水的体积比一般为1:1—1:3。18避免乳化问题：轻摇；滤除不溶性物质；避免高pH；避免使用易乳化的溶剂对，如水-己烷加适量固体NaCl。19液-固提取，主要指固相萃取（solidphaseextraction，SPE）固相萃取小柱有子弹型和针筒型。纯化样品的方式有选择性萃取和选择性冲洗。提取溶剂的蒸发方法：抽真空法、通气流法、离心浓缩系统。20.GC中衍生化目的增加组分的热稳定性和挥发性减少被测组分在样品处理中因吸附性强而导致的损失改善被测组分的色谱行为增加被测物的检测灵敏度和选择性21.HPLC衍生化目的：增加组分的检测灵敏度；改进组分的色谱行为。衍生化方法：柱前衍生化、柱后衍生化第3章分析方法1建立分析检测方法的主要依据：待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况；分析测定的目的与要求；生物样品的类型与预处理方法；实验室条件。2.选择样品预处理方法——首先应考虑：待测药物的理化性质；药物在生物体内的存在状况；药物在生物体内的生物转化(代谢)途径3.分析方法的选择生物样品中的药物浓度——决定分析方法的首要因素。分析方法建立之前,应查阅文献资料——充分了解药物在体内的动力学过程，使所拟定的分析方法——避免受到代谢产物的干扰，适用于实际生物样品测定4.检测条件的筛选：标准物质——照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定——确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度5.在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1．空白溶剂试验——溶剂(方法特异性)，提取回收率以及最低检测浓度；2．空白生物基质试验——endogenouscompounds(方法特异性)，内源性物质的干扰；3．模拟生物样品（QC样品）试验——方法效能指标4．实际生物样品测试——代谢产物(方法特异性)理想的预处理结果是，背景干扰低，被测物回收率高且稳定。6.分析方法验证的内容与要求验证(validation)分析方法的可行性与可靠性使用的技术指标——效能指标使用的样品——通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品内容：首先为分析方法的验证——特异性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中待测药物稳定性的验证——室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环7.方法特异性：指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力，涵盖专属性和选择性。证明内源性物质、相应的代谢物、降解产物以及其他共用药物不干扰样品的测定。8.标准曲线（standardcurve）——calibrationcurveorworkingcurve——生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度）线性范围（linearrang）——标准曲线的最高与最低浓度的区间在定量范围内，模拟生物样品的浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准确度。9.标准曲线——用模拟生物样品建立要求：线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度；不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度10准确度：系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度。——一般用方法回收率表示、也有用相对误差表示）（回收率，%100AMRR）（）（相对误差，%100%100RRAAMRE限度要求——方法回收率应在85%～115%(LOQ（定量下限）附近80%～120%)——RE在±15%(LOQ附近为±20%)11.方法精密度(precision)，系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度。——表示该分析方法的可重复性(reproducibility)——用相对标准差（RSD）表示，RSD一般应≤15%，在LOQ附近RSD应≤20%。12.方法定量限(limitofquantitation，LOQ)，系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度。——标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)。要求：应能满足测定3～5个消除半衰期后或Cmax的1/10-1/20时的生物样品中的药物浓度准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内)；RSD＜20%13.稳定性——包括方法稳定性和样品稳定性方法稳定性——方法的耐用性样品稳定性——生物样品的存放条件和时间、冻-融循环要求——准确度RR85%～115%，RSD＜15%14.萃取回收率（提取回收率）：是指从生物样品基质中回收得到分析药物的响应值与标准物质产生的响应值的百分比。萃取回收率与方法回收率的意义不同：萃取回收率——考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失方法回收率——采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度限度要求——萃取回收率一般应≥50%；高、中浓度的RSD应≤15%；低浓度的RSD应≤20%。第4章高效液相和液质联用1.HPLC的组成：输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、数据处理和计算机控制系统。2.分离因子a对分离度的影响较大，选择合适的流动相对提高分离度具有重要的作用；反相色谱流动相的选择，主要考虑有机相种类与比例、流动相pH值和离子强度（缓冲液浓度）。3.如何快速摸索流动相条件？为快速找到适宜的有机相与水相的比例，一般先用强溶剂（如100%甲醇或90%乙腈）洗脱一定时间（约30min），以保证非极性强保留成分完全被洗脱，然后以10%的比例递减有机相比例；或采用梯度洗脱（5%→100%有机相）进行首次实验。4.流动相pH值的选择？采用反相色谱法分离弱酸性（3≤pKa≤7）或弱碱性（7≤pKa≤8）药物时，通过调节流动相的pH值，可抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形，此技术即反相离子抑制技术。物质以分子形式存在，保留的时间较长；以离子形式存在，保留时间段。在pKa附近时，保留时间变化较大。建立一个耐用的方法，流动相的pH至少与被测物的pKa相差1个pH单位。Tips：当流动相中缓冲液浓度较高或有机相比例较高时，选择甲醇比乙腈更可取，因前者对缓冲盐的溶解度较后者大。特别应注意：缓冲液浓度和pH值是由流动相的水相部分测得的，不要将水相与有机相混合后测定5.超高效液相（UHPLC）特点：高分辨率、高速度、高灵敏度6.高效制备液相色谱三种类型：半制备或小规模制备型(≤100mg)；制备型(O.1100g)；大规模制备型(≥100g)色谱柱内径：10—40mm柱长为10—30cm填料粒径常：5—40μm7.液质联用(LC-MS)接口技术接口的主要作用：将流动相及样品雾化，分离除去大量的流动相分子；使样品分子电离。常用的接口：电喷雾接口ESI、大气压化学离子化接口APCI、基质辅助激光解吸离子化接口MALDI质量分析器四极杆质量分析器，quadrupolemassanalyser离子阱质量分析器，iontrap,IT飞行时间质量分析器，timeofflight,TOF8.基质效应（ME），基质对样品的测定常有显著的干扰，并影响测定结果的准确性，这些影响和干扰被称为产生机制：LC-MS中的基质效应是由样品的共流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制作用。来源：基质效应主要来源于生物样品的内源性组分，包括离子颗粒物成分、强极性化合物和各种有机化合物。最主要的为磷脂。还有样品前处理过程引入。评定基质效应：柱后灌注法、提取后添加法9.