体外细胞培养

第一讲体外细胞培养的基本技术体外细胞培养条件和基本技术体外细胞培养体外培养物的生长生物学细胞系和细胞株培养物的冷冻与复苏培养物的污染、检测和排除一、体外细胞培养条件和基本技术体外细胞培养的优缺点优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。一、体外细胞培养条件（一）、体外培养实验室1.准备室2.培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。空气调节用中央空调或分体式空调机。室顶安装紫外灯等消毒装置。3.缓冲室4.其他实验室（二）、体外培养的设备和器具设备：1.超静工作台，生物安全柜，净化室2.培养箱：温度，湿度，pH值3.倒置显微镜4.水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，超纯水装置5.冰箱6.离心机7.冷冻保存装置8.高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平培养器具：1.过滤除菌装置：Zeiss滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，针头式加压塑料小滤器2.培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿（4）多孔培养板（5）离心管3.移液器4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网（三）培养用液•水和平衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS)水：离子交换水，蒸馏水平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖常用BSS:PBS，RingerEarle，D-Hanks，Hanks•培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetalbovineserum,FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI1640，McCoy5A，HAMF12等3.无血清培养基：干粉型培养基的配制：1）.制备高质量的去离子水(玻璃三蒸馏水)或超纯水2）.加温水至15-30℃之间3）.加干粉入水中，搅拌令之溶解4）.加NaHCO35）.加水至最终量6）.必要时用1NHCl或1NNaOH调节pH，因滤过时pH可能受影响7）.用0.22um或小于此微孔滤膜滤过消毒•其他用液：消化液等1.消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液2.pH调整液：NaHCO3溶液、HEPES溶液3.抗生素液：青链霉素常用的生长培养液：基本培养基80-90％血清(多用小牛血清)10-20％抗生素(多用青霉素100单位／毫升和链霉素100微克／毫升一、细胞体外培养的其它条件一）、无污染的气、液相环境：1、O2（5%CO2+95%空气，O2:21%）2、CO2-pH3、液相环境-渗透压二）、温度三）、生长基质1、多聚赖氨酸：0.05mg/ml2、纤维连接蛋白：1mg/ml3、胶原：1~3mg/ml4、层粘连蛋白：5~10g/ml一、清洗和消毒1.1玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→酸浸→冲洗浸酸液：强液：63克重铬酸钾，1000毫升浓硫酸，200毫升蒸馏水。次强液：120克重铬酸钾，200毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。弱液：100克重铬酸钾，100毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。胶塞清洗：胶塞入水中浸泡→2％Na0H煮沸10-20分钟→自来水冲洗→1％稀盐酸浸泡30分钟→自来水冲洗和蒸馏水漂洗2-3次，晾干备用1.2塑料器皿的清洗：2.包装：局部包装；全包装3.消毒：紫外线，干热消毒，湿热消毒，滤过消毒，射线消毒，消毒剂的使用二、体外细胞培养体外细胞培养类型：原代培养，继代培养一）、基本流程：１mm3的植块→植块培养原代培养：↗动物器官或大组织块→洗去血污→剔除多余成分↙组织剪碎→蛋白酶消化→机械吹打→铜网过滤→离心→细胞悬液→调整细胞数→分离细胞培养二）、实验要点：1、常用实验材料的取材：胚胎、组织、人体手术或活检材料2、分散细胞的方法：１）.机械解离细胞法：吸管吹打法,过筛法,单细胞分离器２).蛋白酶学处理法:胰蛋白酶,胶原酶３).螯合剂解离细胞法:EDTA,柠檬酸钠3、接种和培养过程:：１）.植块培养：接种与培养：优点：比较简单，保留了在体时细胞间的相互作用，因而在体外培养时，植块内细胞容易存活和生长。２）.分散细胞培养：操作过程:优点：解除了植块内部细胞间的组织关系，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。可实现对单一细胞类型进行细胞生物学研究。4、讨论和注意事项相对于植块内的细胞，分离散细胞在体外更难以存活和生长。对于大多数贴壁依赖型细胞来说，如何尽快让接种的细胞贴壁，是决定培养物生长快慢的关键步骤。可选用生长基质表面；降低浮力。细胞密度：105个/ml左右，对大多数动物细胞是比较适中的。三）、原代细胞培养的注意事项1、培养液：培养基的选择，添加剂，培养液的酸碱度，换液。2、培养的空间：通常培养液与液面上空间的体积比以1:10为宜。一、原代培养物需要传代的指标:继代培养1、植块培养;2、分离细胞培养物;3、悬浮细胞培养物二、传代的过程1、主要材料：（1）蛋白酶消化液；（2）培养器皿；（3）培养液及平衡盐溶液2、方法：（1）贴壁生长细胞培养物的传代：吸去旧培养液→PBS或D-Hanks洗→酶消化解离细胞→终止消化→吹打培养器皿底部→收集细胞、洗涤、调整细胞数→接种（2）悬浮培养物的传代：培养物移入离心管→离心、去上清→培养液重悬→接种培养皿→补加培养液三、传代培养的注意事项1、传代的时机与再培养的细胞密度2、传代数与培养物的生长三、体外培养物的生长生物学一、培养细胞的生长与增殖原代培养期：细胞性状与体内原组织相似性大，异质性。传代培养期：细胞增殖旺盛（潜伏期、指数生长期、停滞期），逐渐趋向同质化，正常细胞约可传30-50代，应及早冻存。衰退期：细胞增殖减慢，直至死亡。二、体外细胞培养物的生长类型:：（黏附型细胞；悬浮型细胞）1、黏附型细胞1）多数培养细胞贴附生长，属贴壁依赖性细胞。2)体内：粘附全方位，外形具有复杂的立体特征。体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。成纤维细胞型：梭形、长条形或不规则多角形，胞体一般铺展很开，成群细胞呈现放射状、旋涡状等走行形式。起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此型，如成纤维细胞、肌肉细胞、骨与软骨细胞以及血管内皮细胞等。上皮细胞型：扁平、多角形，细胞间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”，形成单层膜。起源于内、外胚层的细胞体外培养时可能呈现此型，如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。游走细胞型：细胞相互分散，一般不形成集落；在器皿壁上生长位置不固定，经常处于较活跃的变形和游走状态，因此外形不规则且不断变化。主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞。多形细胞型：形态不规则，一般分为胞体和胞突两部分。胞突为细长形，似丝状伪足。胞体虽略呈多角形。主要是神经元和神经胶质细胞2、悬浮型细胞细胞在培养时不粘附于支持物上，而是呈悬浮生长状态，如某些癌细胞和血液白细胞。细胞悬浮生长时胞体为圆形。适于大量繁殖。三、培养细胞的生长状况观察一）常规观察1培养液：颜色、透明度等；2细胞生长概况及形态变化：细胞轮廓、折光性、胞内颗粒等；3微生物污染状况：二）细胞生长状况观察1.细胞计数：细胞计数仪；细胞计数板制备细胞悬液，稀释成合适的浓度；加至细胞计数板中央凹槽处，显微镜下计算四角大方格内细胞总数；按照公式计算悬液中细胞密度。2.细胞生长曲线细胞生长曲线是衡量细胞增殖快慢的重要指标。细胞计数法：MTT（CCK-8）法潜伏期：细胞有生长话动而无细胞分裂。潜伏期一般为6～24小时。对数生长期：细胞数随时间成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，虽有活力但基本不再分裂。3.细胞分裂指数（mitoticindex,MI）培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。一般细胞的MI约为0.1－0.5%。原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%－5%。4.细胞周期流式细胞仪测定；同位素标记测定：3H-TdR掺入法细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间。群体倍增时间通常长于单个细胞周期。四、细胞活力的检测方法1、台盼蓝排斥试验台盼蓝（Trypanblue）染色使死细胞呈蓝色，活细胞不着色。计数法得到活细胞比例。此法简单快速。注意及时检测，时间过长部分活细胞亦被染色2、克隆（集落）形成试验测定单个细胞增殖能力，克隆形成率高者独立生存能力强。平板克隆形成试验软琼脂克隆形成试验：多用于检测肿瘤细胞或转化细胞。利用肿瘤细胞的非锚着生长依赖性，将其悬浮培养于软琼脂内。可根据其克隆形成率判断细胞的恶性程度，亦可用此法进行亚克隆分离3.3H-TdR掺入法3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR），在DNA复制时掺入至新合成的DNA链中，从而使子细胞被3H标记，测定3H的放射性脉冲数即可比较细胞增殖活性。4.细胞活力测定的MTT比色法MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）是线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，在活细胞中MTT能被其线粒体脱氢酶还原为formazan颗粒，溶于异丙醇或DMSO之后，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，因此根据呈现的OD值可反应细胞的代谢水平。死细胞无此酶活性。MTT法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。亦常用于测定生长曲线。四、细胞系和细胞株一、基本概念细胞系(cellline)：从原代培养物经传代后得来的一群不均一的细胞。由原先组成原代培养物的所有细胞类型组成，但一般以某种细胞为主。细胞株(cellstrain)：通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。如一定标记染色体、对某种病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性等，这些特性在以后的培养中必须持续存在。有限细胞株（finitecellstrain）连续细胞株（continuouscellstrain二、建立细胞系（株）的档案1、培养细胞的来源交代细胞供体所属物种、年龄、性别、器官或组织来源。对肿瘤组织，应说明临床病理诊断结果、组织来源、病例号等。说明培养基、血清等的使用条件。2、细胞生物学特性说明细胞的一般形态、特征性结构、生长曲线与分裂指数、倍增时间、集落形成率、染色体特性等。对腺细胞应查明有无蛋白质或激素等分泌产物；对肿瘤细胞应作琼脂培养、异体动物成瘤性、组织浸润能力等检测。五、培养物的冷冻与复苏一、培养物的冷冻保存与复苏原理冷冻保存：将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度（一般是低于-70℃的超低温条件），并在此温度下对其长期保存的过程。复苏：以一定的复温速率将冻存的培养物恢复到常温的过程。一）冷冻保护剂甘油、DMSO渗透到细胞内，避免细胞过分脱水皱缩，减少水分子形成冰晶，保护酶和蛋白质等。添加浓度通常为10%。二）冷冻速率速度过慢：脱水严重，体积严重收缩，溶质损伤；速度过快：胞内冰晶损伤严重三）冷冻保存温度1、液氮温度（-196℃）是目前最佳的冷冻保存温度。2、-70℃～-80℃，短期保存一个月内3、冰点到-40℃保存效果不佳四）复温速率37-40℃水浴中，于1~2min内快速完成复温二、冻存方法（1）待冻存细胞悬液的准备（2）分级冷冻（3）记录三、冻存细胞的复苏从液氮中取出后，立即投入到37～40℃温水中，溶解后尽快离心弃除冷冻保护液。六、培养物的污染、检测和排除一、培养物的污染与检测1.污染的内容：1）微生物：真菌、细菌和病毒2）化学物：影响细胞生存非细胞所需的细胞成分3）细胞：其他非同一种细胞2.污染对细胞的影响：轻者：细胞生长缓慢、分裂相减少、细胞变得粗糙、轮廓增强重者：细胞增殖停止、分裂相消失、胞质中出现大量堆积物、细胞变圆、脱落3.污染的途径：空气、清洗消毒、操作、血清、组织