使用OxytonaISSR分子标记罂粟的分子特征

使用OxytonaISSR分子标记罂粟的分子特征摘要：大红罂粟第OxytonaBernh种，属于罂粟属，广泛存在于土耳其本土植物。它们含有的高生物碱含量具有重要商业价值。因为罂粟属部分Oxytona也有类似的形态特征，所以不容易区分这些种类。我们使用的跨简单重复序列（ISSR）分子标记系统，以确定本节的分子特征。在这项研究中，从土耳其的5个不同地区收集到180个品种，用20个ISSR引物就行研究。共获得82条带，其中80为多态。平均遗传距离是0.35，香农指数为0.50，多态率为96.97％。引物AT10数目带最少，而引物AT19和AT3拥有最大数量。总之，ISSR标记系统可以用于第Oxytona分类。关键词：罂粟；Oxytona；ISSR；分子标记；系统发育1引言土耳其是许多物种基因起源的地方。属于罂粟科的物种分布在北半球。有世界各地50类群和110种罂粟在土耳其自然生长。罂粟有许多种类，包括多年生草本植物，由大红罂粟石斛，荭体育L.和P.伪东方。他们的生物碱含量十分的重要，如可待因和蒂巴因。罂粟属是一年生植物，因为它的吗啡和可卡因的含量高因此可以商业化种植的，而大红可以生产生物碱蒂巴因，它可以转化为某些阿片镇痛药，如可待因，吗啡酮，羟考酮。属于第Oxytona物种可以利用形态学，细胞学，植物化学来区分，但区别并不总是很清楚。部分Oxytona是多倍体的结构。P.大红是二倍体（2N=14），P.荭是四倍体（为2n=28）和P伪东方是异源六倍体（为2n=42）。据报道，罂粟往往是非法种植的。园林植物与体育荭混合种植，区分P.大红，P.荭和P伪东方在增长其营养阶段是困难的。以前形态学观察变化与染色体数目包括花色，花瓣上，苞片黑的斑点，叶分析的基础上的变化。然而，在罂粟种间的形态学和化学分类学特征方面的歧视仍然存在一些问题因为环境条件可能会影响他们的各种特性，以及种间杂交（米洛等，1988;奥亚拉等，1990;利维和米洛，1991）。因为它们的物种特异性的重要性，因此能正确识别物种非常重要。遗传多样性是在不同的地区加入提供这种多样性可以大大有助于高效种质资源的管理和利用的发展战略之间的遗传关系的植物育种计划的知识很重要。形态特征的测量是其中估计物种的遗传多样性的一种方法。他们是常用的参数，因为它们提供了量化的遗传变异，同时评估基因型表现相关生长环境的一个简单的技术。然而，评估形态特征是密集和植物的表型可塑性使得环境变化的一个主要问题。简单重复序列（ISSR）标记聚合酶链式反应（PCR）使用单一的扩增引物微卫星基序为目标的简单序列的子集组成的重复为基础。固态继电器，或微卫星和ISSR分析已确认为分子标记辅助选择有用的分2子标记，遗传多样性，种群遗传分析，可以用在不同品种的其他用途分析。然而，这种标记系统从未使用过的罂粟节Oxytona的遗传特征。本研究的目的是确定在第Oxytona的遗传多样性。其中地理来源，染色体数目和分子标记数据的相关性进行了评价。2材料与方法2.1植物材料共有180种质第Oxytona在这项研究中使用。荭体育和P.伪东方种质采自埃尔津詹省，锡瓦斯，通杰利，和尼代的野外植物，保藏号为分别99，23，135，。四个大红罂粟品种都来自农业部的安卡拉大学学院。所有品种都根据染色体数目计算，他们归纳为4P.乌饭，P.50荭，106P.伪东方，和20个未知种质。将植物种植在Gaziosmanpaşa大学的研究领域。2.2DNA的提取从180个品种提取新鲜的嫩叶。总DNA采用Fermentas公司的基因组DNA提取试剂盒隔离DNA制备物以1％琼脂糖凝胶电泳定量。用100的终浓度纳克mL-1的分离的DNA用于PCR分析2.3ISSR分析二十个ISSR引物（AT1-AT20通用引物）是从İontek（İontek有限公司，土耳其）获得。每次25毫升PCR反应含20纳克基因组DNA模板，10X缓冲液无镁（BioBasic，加拿大），20毫米硫酸镁10毫米的dNTPs，1单位TaqDNA聚合酶（Promega公司，美国），和0.4微米每个ISSR引物。PCRamplificationswere在阿波罗仪表ATC401梯度热循环仪进行。在94℃下进行PCR扩增程序为5分钟，接着进行40个循环：94℃30秒，在42-63℃下进行60秒，并在72℃持续2分钟。最后，该过程被延长为72℃7分钟。扩增产物进行表征于1％琼脂糖凝胶（浸渍）在120伏2.5小时，可视化用溴化乙锭（0.5克/毫升）在UV光下，然后使用凝胶-逻辑200影像系统（伊斯曼-柯达公司，美国）拍照。ISSR分子片段的大小是由使用1kb的DNA梯（SibEnzymeM11，美国）为标准估算。3.结果二十个ISSR引物对180种质进行分析。ISSR引物产生82条带，平均每个引物扩增2.20条带。82单但形态，80呈多形性，多态率为96.97％。与每个引物检测到的多态性条带数为3（AT10）到5（AT3和AT19）。遗传相似系数矩阵与非加权对群法的引物构建的算术平均值。树状图显示了180份种质间的关系，构建（图）。该Nei氏指数相似系数的值介于0到1之间，平均为0.35。不包括具有0.00的相似系数的植物，90对植物以0.09的相似系数;最远的遗传距离出现在15对植物，Shannon指数为0.50。系统发育分析产生的2大组，A和B，即由16和17个亚类，分别为（图）。根据种群染色体数目检查，有14条染色体的种群集中在4组。28条染色体集中只有1组，并与42条染色体集中在8组植物。根据种群在各区域检查，从尼代本身集中在13个组收集的植物，从埃尔津詹区域集中在1组中，与除此以外的3区域的植物没有表现出分离4讨论本分子标记系统之前已经作为一种有效的工具，用于评估系统发育关系，并在水仙节Pseudonarcissi遗传多样性（希门尼斯等人，2009），大麦（Wang等，2009），萝卜（刘等人。，2008），胡芦（Dangi等，2004），和P.催眠种质（阿查里雅与夏尔马，2009）。这些研究给出更好地了解物种的关系和发展育种策略的重要线索。种群间的分子标记系统，在ISSR标记技术是受欢迎的，因为它不需要对基因组的先验知识及其应用简单，价格十分便宜（阿拉姆等人，2009;Huang等，2009;的Bayraktar＆阿寒湖，2011;哈姆扎等人，2012）然而，一直在用ISSR分子标记的部分Oxytona的遗传多样性以前没有报告。在这项研究中，我们使用了ISSR分子标记调查罂粟节Oxytona不同种质之间的遗传相似水平。多态性DNA（RAPD）的随机扩增和质rpL16基因属下和rpl16-rpl14间隔区序列先前已经研究了这一节。在本研究中，获得多态性（96.97％）的比例很高。在ISSR标记系统观察到的遗传变异的高水平是与已经使用的部分OxytonaRAPD分子标记的结果一致。多态性率比RAPD84.3％的多态性高（Parmaksız＆奥兹坎，2011）。我们利用ISSR标记所获得的聚类分析显示了类似的RAPD标记，但在某些基因型的定位有所不同。这些结果表明，ISSR分子标记比RAPD标记提供更多的解析力。Goulão等。（2001）和Huang等人。（2009）也表明ISSR标记系统比RAPD更有效。据观察，二核苷酸重复的引物（TC）8G和（CT）8G，AT3和AT19，生产数量最多带，分别与无单态引物为观察。因为它们所产生多个最高波段，这些引物可用于识别本节的植物。该种质的聚类特点是具有形态和染色体特征和生物地理区域的数据。我们的系统进化的结果表明，该部分Oxytona聚为2个主要组（图）。当我们分析树状图，群体聚为33个不同的组。根据染色体数目，体育乌饭居住在4个不同的组，P.伪东方集中在8个不同的组，和P.东方产生1组置于其自身。从相同的区域收集到的部分人群聚集在一起。从尼代和埃尔津詹收集的种质居住在同一个分支，而来自其他地区收集的种质被定位在不同的分支中所构建的系统发育树状图;然而，他们分组在靠近分支。因此，可以得出结论，在授粉率明显高的尼代加入。这些观察结果表明，是其中显著的遗传变异部分Oxytona人群。来自不同区域或什至在同一区域的种质可以显示没有相似性（Dangi等人，2004）。在我们的研究，种质收集从部分分组彼此之间5个不同的区域，和区域没有表现出明显的歧视。Parmaksız和奥兹坎（2011）指出，野生种本节中表现出更多的多样性。它可以被认为，由于它们的花粉，种子可以很容易地通过风在长距离传播，基因流动变得容易之间种群。它们是多年生的事实也可能会考虑将帮助老基因型从遗传物质的局部维修。我们的研究分析表明更高水平的群体内的变异。8个种群有0.00的相似系数和这些被发现特别是东方体育的尼代和通杰利人群和P.伪东方。九十的群体出现了更接近彼此以0.09的相似系数在荭体育和P.伪的种群，和其区域未见显著分离。该形态特征像萼片，萼片的颜色，或萼片数在这两个群体也表现为局部或完整的相似性。最远的遗传距离出现在15对植物，虽然它们的形态特征表现4为局部的相似性这3个种群加入可能会显示中间种质自然产生的种间杂交（葛浩文，1974;庄山等人，1998;卡罗兰等，2002，2006;焦什昆等，2010;Dirmenci等人，2010），因此，真正的这些命名种质仍在争论。在一般情况下，即使分子分析比形态分析好，使用参数从两种方法更可靠会对变异的表征高效Oxytona（Parmaksız和奥兹坎，2011）在中间部分Oxytona结论，遗传多样性是第一次用ISSR分子标记分析。进行了ISSR-PCR法的优化。因此，对于映射程序的开发部分Oxytona，为此，该信息仍然不可用其它标记系统必须进行分析。参考文献[1]JournalofInfectiousDiseases5:155–160.AlamMA,[2]NaikPK&MishraGP(2009).CongruenceofRAPDandISSRmarkersforevaluationofgenomicrelationshipamong28populationsofPodophyllumhexandrumRoylefromHimachalPradesh,India.TurkishJournalofBotany33:1–12.[3]AtalayI(1994).VegetationGeographyofTurkey.EgeUniversityPress,İzmir.BayraktarH&AkanK(2011).GeneticcharacterizationofPyrenophoragramineaisolatesandthereactionsofsomebarleycultivarstoleafstripediseaseundergreenhouseconditions.TurkishJournalofAgricultureandForestry36:329–339.[4]BeuningenVLT&BuschRH(1997).GeneticdiversityamongNorthAmericanspringwheatcultivars:III.Clusteranalysisbasedonquantitativemorphologicaltraits.CropScience37:981–988.[5]BudakH,ShearmanRC,ParmaksizI&DweikatI(2004).ComparativeanalysisofseededandvegetativebiotypebuffalograssesbasedonphylogeneticrelationshipusingISSRs,SSRs,RAPDs,andSRAPs.TheoreticalandAppliedGenetics109:280–288.[6]CarolanJC,HookILI,ChaseMW,KadereitJW&HodkınsonTR(2006).Phy