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1岱衢族大黄鱼线粒体基因组全序列的扩增及其特异鉴别引物的开发摘要：本研究使用15对引物PCR扩增、克隆获得了岱衢族和闽-粤东族大黄鱼线粒体基因全长序列，结合NCBI上的已知序列FJ595214和NC011710分析出大黄鱼线粒体基因的高变异区域；通过2对引物扩增了岱衢族和闽-粤东族样本各25条的高变区域，对测序结果分析处理分成3个不同的分类单元（OperationalTaxonomicUnit，OTU）：D1-N1、D1-N2和D2；岱衢族大黄鱼25个样品均为D1-N1型；而闽-粤东族大黄鱼中可以分为3个类型：D1-N1型，4个样品，D1-N2型，5个样品，D2型，16个样品；然后设计出能有效区分不同OTU分型的特异鉴别引物J1和J2，并对PCR鉴别的条件进行了优化，退火温度和循环数优选55.8℃、28；使用鉴别引物进行PCR反应电泳拍照后，如果样品分型为D1-N2型和D2型，则100%为闽-粤东族大黄鱼，如果样品OTU分型为D1-N1，则该样品为岱衢族大黄鱼的概率为86.2%，闽-粤东族大黄鱼的概率为13.8%，在此研究基础上，可再结合其它的差异区域分型来更进一步提高岱衢族大黄鱼鉴别的准确率。研究结果为岱衢族大黄鱼的种质资源保护、良种选育和市场销售等方面提供技术支持。关键词：；岱衢族大黄鱼；闽-粤东族大黄鱼；线粒体基因组；OTU;鉴别TheamplificationofthecompletemitochondrialgenomeoftheDai-quStockPseudosciaenacroceaandthedevelopmentofitsdiagnosticprimersAbstract:ThecompletemitochondrialDNA(mtDNA)genomesofPseudosciaenacroceasampledfromMin-yueandDai-quStockwereamplifiedbyPCRwith15primerpairsandsequencing,withwhichhighvariabilityregionsofPseudosciaenacroceawereanalysisedcombiningwithknownsequencesinNCBI(FJ595214andNC011710).Thesequencesofhighvariabilityregionsfrom25Min-yueandDai-quStocksamplesrespectivelywereobtainedwith2primerpairs,whichweredividedinto3OperationalTaxonomicUnits(OTUs):D1-N1、D1-N2andD2.Theresultsindicatedthat:alltheDai-quStocksampleswereclusteredintoD1-N1type;Min-yueStocksampleswereclusteredintoD1-N1、D1-N2andD2typewhichaccoutfor4、5、16,respectively.PrimerpairsJ1andJ2weredesignedtosignificantlydistinguishdifferentOTUs,andPCRconditionswereoptimizatedforidentificationthatannealingtemperatureandcyclenumberwere55.8℃and28.AfterPCRprocuctamplifiedwithdiagnosticprimersisphotoedbygelimagingsystem,theaccuraterateofidentificationforMin-yueStockPseudosciaenacroceais100%ifthebandpatternonphotobelongstoD1-N2orD2type,andtheaccuraterateofidentificationforDai-quandMin-yueStockPseudosciaenacroceaarerespectively86.2%and13.8%ifitbelongstoD1-N1type.Basedonthisresearch,theaccuraterateofidentificationforDai-quStockPseudosciaenacroceacanbepromotedbycombinatingwithOTUsforotherhighvariabilityregions.Theresearchresultsprovidetechnicalsupportforvarietiesresourcesconservation、selectiveimprovedvarietyandmaketsalesoftheDai-quStockPseudosciaenacrocea.Keywords:Dai-quStockPseudosciaenacrocea;Min-yueStockPseudosciaenacrocea;Mitochondrialgenomes;OTU;Identification2引言岱衢族大黄鱼曾是东海最主要的经济鱼类之一，列“四大经济鱼类”之首。由于酷渔滥捕和缺乏应有的种质资源保护措施，野生岱衢族大黄鱼资源濒临衰竭[1]。为有效保护岱衢族大黄鱼的种质资源，2007年宁波市开始启动岱衢族大黄鱼野生亲本采捕、保活、繁育和种质库建设项目，在岱衢洋成功捕获8尾亲鱼。经过驯养、促熟、催产和人工繁育，2010年成功培育出子一代岱衢族大黄鱼15万尾，截至到2011年底已规模化生产出全长5厘米以上岱衢族大黄鱼340万尾[2]。因岱衢族大黄鱼在体色、体型和风味方面等方面的优势，在市场上价格要比闽-粤东族大黄鱼高；岱衢族大黄鱼体色略显金黄色，闽-粤东族大黄鱼体色较淡；在体型上，岱衢族大黄鱼体型较瘦长，闽-粤东族大黄鱼则略胖；在营养价值和风味方面，李明云等[3]研究发现岱衢族大黄鱼肌肉组织中氨基酸总量、人体必需氨基酸、鲜味氨基酸以及脂肪酸等反映肉质风味的主要营养价值指标都显著高于闽-粤东族官井洋家系大黄鱼。此外，陈琳等[4]报道岱衢族大黄鱼在生长速度、成活率、发病率和饵料系数等方面比闽-粤东族大黄鱼占有明显优势，而徐镇等[5]报道岱衢族大黄鱼抗寒能力稍强于福建的闽-粤东族大黄鱼，而浙江地处纬度高，冬季海水温度低，抗寒能力对于越冬养殖很重要。在宁波、舟山地区养殖的大黄鱼绝大部分为闽-粤东族大黄鱼，其在外观上与岱衢族大黄鱼很相似，采用传统的性状观察，主观性强，也很难进行有效的区分。因此，开发岱衢族大黄鱼区别于闽-粤东族大黄鱼的鉴别方法，对于种质资源保护、良种选育和市场销售等方面都显得非常重要。目前对于岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼的遗传多样性研究较多[6-11]，但对于岱衢族大黄鱼的鉴别方法仅有少量报道，丁文超等[12]通过对10个贡献率较大的形态变量进行逐步判别分析,建立了大黄鱼4个家系的判别公式,综合判别率为92.5%，其中岱衢洋大黄鱼样本选自野生种驯化的第2代，然而随着繁育代数的增加，岱衢族大黄鱼的形态性状难免发生变化，从而会对综合判别率造成影响。中国专利(专利号：200610135259)[13]公开了不同种群大黄鱼的鉴别引物和鉴别方法,采用单引物RAPD-PCR扩增图谱就可区分岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼;此外,丁诗华等[8]发现使用引物S11进行RAPD-PCR扩增出官井洋选育群体特征性条带，而岱衢洋大黄鱼则只有10%能扩增出此条带。然而，RAPD-PCR技术对DNA模板的质量、扩增的条件和体系都有很高的要求，而其自身固有的缺陷即可重复性差很难克服[14-15]。线粒体基因具有母系遗传及高进化速率等特点，是研究基因组进化、种群遗传学分析的有用标记[10,16-17]。本研究拟PCR扩增出岱衢族大黄鱼和闽-粤东族大黄鱼线粒体基因全长序列，通过生物信息学分析两地理种群的线粒体基因之间的高变异区域；获取多个样本的高变异区域的序列信息，寻找岱衢族大黄鱼区别于闽-粤东族大黄鱼的高频差异位点，然后结合不同高变异区域的高频差异位点的分型来综合鉴别岱衢族大黄鱼；建立通过利用差异位点设计特异性辨别引物、优化PCR扩增的条件及体系、根据凝胶电泳图谱来鉴别岱衢族大黄鱼的标准化方法体系。1材料与方法1.1实验材料采集岱衢族、闽-粤东族大黄鱼养殖个体各25尾,2010年11月取自浙江象山黄避岙养殖网箱.1.2总DNA的提取取鱼体背部肌肉（去除鳞片和皮肤）约0.1g，酚/氯仿法抽提大黄鱼总DNA[18]，-20℃下保存备用.1.3大黄鱼线粒体全长序列扩增31.3.1引物设计和PCR扩增模板DNA：岱衢族和闽-粤东族大黄鱼各1条；扩增大黄鱼线粒体全长序列的引物见表1。PCR反应的模板DNA浓度约为100ng，反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer2.5μL，dNTPs4μL（各2.5mmol/L）,引物各1μL（10μmol/L）,Taq酶0.2μL（5U/μL）。PCR反应条件为：95℃预变性3min；94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min30s，35个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物采用试剂盒切胶纯化。1.3.2克隆和测序将15个PCR产物纯化后分别与pMD18-T载体4℃过夜连接，转化感受态细胞E.coliDH5α。用引物M13F/R随机检测，每个克隆均送出3个阳性克隆子正反双向进行测序，以保证序列的准确性。1.3.3序列分析测序结果采用DAMBE、VectorNTI7.0等软件进行拼接，对大黄鱼线粒体基因全长序列进行分析。1.4大黄鱼高变异区域序列扩增1.4.1设计引物将获取的岱衢族和闽-粤东族大黄鱼各1条的线粒体基因全长序列，结合NCBI上的大黄鱼mtDNA全序列(序列号:FJ595214和NC011710)用VectorNTI7.0软件进行比对找出高变异区域，在高变异区两端的保守区域区设计引物对B1和B2（见表1）。1.4.2PCR扩增、克隆和测序将岱衢族和闽-粤东族大黄鱼样品各25条先用B1引物对进行PCR扩增、克隆测序，再用B2引物对扩增25条岱衢族大黄鱼和9条闽-粤东族大黄鱼样品。PCR扩增反应体系及条件、克隆测序和序列分析等方法同上。1.5岱衢族大黄鱼的特异性鉴别1.5.1岱衢族大黄鱼特异鉴别引物的设计根据高变异区序列比对分析，针对两地理种群大黄鱼变异位点设计出岱衢族大黄鱼特异鉴别引物对J1和J2（见表1）。1.5.2鉴别PCR扩增条件的优化Real-timePCR扩增体系25ul,包括SYBRPremixEXTaq(2×)12.5ul,10uM上下游引物各0.5ul，10ng/ulDNA1ul,ddH2O10.5ul。扩增程序：95℃预变性2min；94℃变性30s，4个温度梯度（51.2℃、53.6℃、55.8℃、58.6℃）退火40s，72℃延伸35s，35个循环。Real-timePCR产物1%琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。通过比较使用特异鉴别引物对岱衢族和闽-粤东族大黄鱼样品Real-timePCR扩增的Ct值差值来确定最优的退火温度和循环数。1.5.3PCR验证用引物对J1和J2分别对25个岱衢族和闽-粤东族大黄鱼样品进行PCR扩增验证。PCR反应体系总体积为25μL，其中10×Buffer2.5μL，dNTPs4μL（各2.5mmol/L）,引物各0.5μL（10μmol/L）,Taq酶0.2μL（5U/μL），模板DNA浓度为10ng（J1引物对）和40ng(J2引物对)。PCR反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性30s，55.8℃退火40s，72℃延伸35s，28个循环；最后72℃延伸5min。2结果与分析2.1大黄鱼线粒体全长序列的分析使用15对大黄鱼线粒体基因扩增引物进行PCR反应，获得特异性的