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食欲肽受体与GPR103形成异质二聚体在阿尔茨海默病机理中发挥神经保护作用摘要：食欲肽是一种能够调节睡眠作息周期和进食行为的神经肽。QRFP是一种新发现的神经肽，也有着类似的食欲调节作用，因此在能量内稳态和进食方面也有着重要的作用。而QRFP和其受体GPR103互相作用的信号通路和病理功能还不是很清楚。阿茨海默病，也称老年痴呆病的患者会出现夜间行为的增加，过度白日睡眠，和体重减少。他们重点探究食欲肽和QRFP在阿尔茨海默致病机理中的作用。本文认为海马区食欲肽受体和GPR103在阿尔茨海默病患者的海马角区域都会下调。利用体外模型证明了β样淀粉蛋白沉积和tau蛋白过度磷酸化是这种下调的主要原因。转录调控揭示了神经保护作用对食欲肽和QRFP都有作用。最后，利用BRET和FRET技术证明了OXRs和GPR103能形成功能型异质二聚体参与ERK1/2活性形成。食欲肽系统中的病理干预可能成为一种对类似于阿尔茨海默病等疾病的治疗方法，和神经保护信号通路的信号增强。前言食欲肽（OX）是调节睡觉-觉醒周期，进食行为，能量平衡和内稳态。他们由前体食欲肽（PPO）分子切割成两种形态：食欲肽A（OXA）和食欲肽B（OXB）。OXA和OXB又分别是两种G蛋白偶联受体的配体分子：食欲肽受体1（OX1R）和食欲肽受体2（OX2R）。50-80000OX可以产生的神经元多分布在大脑的外侧下丘脑（LHA），蓝斑核（LC），结节乳头核（TMN），室旁核（PVN）和中缝核等，这些区域都是和进食，食欲及睡眠周期相关。一直以来，人们认为在AD病人的食欲肽系统与常人不同。比如，与正常人的对照发现，免疫阳性神经元OR-A的数量降低同时脑脊髓液的水平降低。而且，Aβ42CSF水平和OR-A之间的联系能够证明AD致病机理和食欲肽缺失的关系。在最近的研究中，食欲肽水平和AD患者中Tau和过度磷酸化的Tau水平呈正相关。QRFP是一种新发现的神经肽，而且具有和食欲肽有类似食欲调节功能作用。它是GPCR的配体，GPR103，在下丘脑腹下侧、PVN、大脑外侧的视网膜、睾丸、前列腺等部位。GPR103分别和OX1R、OX2R在蛋白序列上有48%和47%的一致性。在这些组织中的GPR103也有其他的生理功能比如说，促性腺轴形成，骨形成，和肾上腺类固醇的生成。但具体的信号通路和病理机理仍然是难以解释清楚的。AD是一种缓慢而持续地丧失认知功能，行为功能，包括记忆力，人格变化，痴呆，语言能力下降，甚至失眠体重下降的疾病。而且主要诱因是β淀粉样蛋白的积沉和微管蛋白形成相关的tau蛋白质的过磷酸化，由此导致了神经元的损伤甚至死亡。临床症状也观察到这两者有着密切的关联。至今，OXRs和GPR103作为信号转导通路的关键，还未在AD患者大脑中研究过。本文中，通过研究AD患者大脑中的GPCRs的细胞内分布和表达得到依靠转录水平达到神经保护作用的新证据。已知GPCRs的二聚体形式是受体及信号转导特异性的关键，本文第一次证明了GPR103和OXRs形成了功能性二聚体从而产生了神经保护的作用。结果OXRs和GPR103在AD患者中的表达和胞内分布情况。在qPCR分析中，早发型家族阿茨海默病（EOFAD）和晚发型家族阿茨海默病（LOAD）的病人和正常人相比，海马组织中OX1R的表达量明显降低，而正常者又分老年组和青年组，前者也低于后者的值。对LOAD组合对照组来说，两者唯一的正相关就是OX1R、OX2R和GPR103。为了减少对照和EOFAD组之间的误差，重新计算了EOFAD样品表达值，所以对照组的平均年龄是57而EOFAD是58岁，OX1R、OX2R和GPR103在对照组的RQ值是3.2,1.5和1.0，而OX1R、OX2R和GPR103在EOFAD中的RQ值分别是0.08,0.38和0.46。免疫组化实验结果显示，与健康组相比，LOAD患者大脑中OX1R蛋白质表达量的下调主要集中在DG和CA这两个海马区部分。而OX2R对LOAD患者来说，在CA区域的蛋白质表达量下降最明显。至于GPR103，不EOFAD还是LOAD，比较与年轻组或者年老祖，CA区域的表达量在持续下降。长期观察结果发现，对雄性小鼠CA1区域注射OX1R拮抗剂后会伤害其空间学习能力和记忆力。淀粉蛋白斑的形成和Tau过度磷酸化会下调OXRs和GPR103的表达量。为了进一步观察OXRs和GPR103降低的原因，本文建立了一个体外模型，依靠SH-SY5Y细胞系的成神经细胞瘤的神经元分化功能。神经元的表型是通过测量细胞轴突的长度来确定，神经元特殊烯醇酶、微管蛋白形成相关的tau蛋白、神经原质蛋白1的增加和巢蛋白的降低。神经元反应曲线可以标靶关键体细胞，内核，树突、轴突蛋白等来确定已分化神经元细胞和未分化神经元。然而，神经细胞的表型的获得和OXRs和GPR103的表达增加相关。接着三种受体的表达量都有明显增加。神经细胞通过Aβ42和硫酸锌处理以诱导淀粉蛋白斑和tau蛋白的过度磷酸化，在体外模仿AD的细胞环境。如果在tau蛋白的214丝氨酸位点出现过磷酸化，就证明了用硫酸锌的处理是可以起到相应作用的。GAPDH是用来作为内参对照的。而大脑中Tau蛋白质共有6中异构体，因此也就解释了为何能够检测到多种不同的结合键。对OX1R、OX2R和GPR103在Aβ42处理之后也有表达量的下降。Tau过磷酸化和OX1R及GPR103的表达下降有关系。在Aβ42和硫酸锌共同处理后48小时，所有受体都明显下降。而效果，却无法检测。这些成果提供了证据表明两种AD的能够降低GPCRs特质，而且指出在临床中表达降低的机制。食欲肽和QRFP的神经保护作用。为了深入阐明这些神经受体所扮演的角色，本文作者构建了一个全基因组的基因芯片。而这些基因数据则通过KEGG方法进行分析。OXA能够显著调控346个基因的表达，包括和神经元保护相关的基因。OXA还增大NF-KB信号通路中关于细胞存活，修复，神经元增殖，学习和记忆力相关的基因。OXB则改变了KEGG通路中715个基因，他们涉及了PI3K-Akt、Jak-STAT信号通路，神经元保护受体相互作用，和阿尔茨海默病。下调PI3K-Akt信号通路重点在于OXB的神经保护功能。QRFP的处理可影响2056个基因。主要的KEGG通路包括：神经保护配体受体互作，代谢途径，细胞因子受体互作，PI3K-Akt,Jak-STAT,MAPK,TNF,NF-KB和AD。QRFP调节16个基因包括了PI3K-Akt和13个MAPK信号转导通路，其中很多涉及了细胞生存。QRFP也调节MAPK通路的13个基因，和7个电信号依赖性钙离子通道能够作为神经递质释放的调节器。这些数据分析都是利用GeneOntology(GO)的分子功能得到的。OX1R和OX2R与GPR103形成二聚体，参与ERK1/2激活。我们已知三种GPCR之间的同源性，和QRFP对OX1R的诱导激活，这说明在OXR/GPR103信号通路中存在更高阶的复杂性。并利用两者形成二聚体的潜质而深入研究。GPCR的二聚体形式一直以来对受体功能有着关键作用，包括其激动剂的亲和力，效力，转移，信号转导的特异性，特别是G蛋白的偶联作用。用BRET和FRET手段，本文提供了OX1R和GPR103，OX2R和GPR103之间存在二聚体形式的新证据。而且所有者三种多肽都可以激活ERK1/2的磷酸化。ERK1/2是保护神经元的重要分子。特异性的OXR拮抗剂SB-334867（选择性的OX1R的拮抗剂）和TCSOX229（选择性的OX2R的拮抗剂）能够摧毁OXA和OXB的作用。用两种拮抗剂处理神经元方向分化的细胞会导致QRFP诱导的下游ERK1/2磷酸化失败，暗示了其中的机制。进一步的，对神经元分化的SH-SY5Y细胞的免疫荧光实验证明，OX1R和GPR103，OX2R和GPR103的确出现共定位的现象，更加证明异质二聚体的存在。讨论由之前各种证据可证明GPR103和OXR形成了有功能的异质二聚体。最近的研究表明GPCR二聚体的生理相关功能。比如说，显性失活的AT2受体单聚体在AD相似病理的转基因鼠中诱导G蛋白的捕获和神经退性的病症。另外，OXRs也表现出形成能够和其他类似CB1受体构成组成型同源或者异源的二聚体。虽然OXRs并不一定在大脑里和GPR103共表达，但是GPR103只要在有单一OXRs存在的情况下便会更倾向与之形成二聚体。在临床患者的样品中，在mRNA水平上GPR103和OX1R总是存在正相关。而QPRF的芯片结果显示OX1R表达的增加，暗示QRFP的增加。还有，利用OXR相应的拮抗剂，能够截断下游ERK1/2的磷酸化。免疫荧光实验再次证明了OXRs和GPR103的共定位效果。推测GPR103/OXRs在海马区域的共表达作用非常有趣也非常重要，因为对于GPR103的信号转导下游功能会有更全面的理解。对于人类老年痴呆症的深入研究有着临床潜力。总之，可以认为在健康大脑中，GPR103和OXRs形成二聚体能够为神经元提供保护作用。在老年痴呆患者中。淀粉蛋白斑和tau蛋白的过度磷酸化共同导致了OX1R、OX2R和GPR103受体在RNA和蛋白质水平的降低。这些不仅仅导致体重降低和睡眠失调的症状，而且会导致神经保护作用的丧失，比如通过截断下游ERK1/2的作用。然后这些共同导致了老年痴呆症的产生。参考文献DaviesJ,ChenJ,PinkR,etal.OrexinreceptorsexertaneuroprotectiveeffectinAlzheimer’sdisease(AD)viaheterodimerizationwithGPR103[J].Scientificreports,2015,5.