八检测口蹄疫病毒抗原的方法

八、检测口蹄疫病毒抗原的方法（一）口蹄疫反向被动红细胞凝集试验（反向被动血凝）红细胞膜具有吸附抗原或抗体的特性，将提纯的口蹄疫抗体（IgG）在pH4.0醋酸缓冲液中致敏绵羊红细胞，当这种被致敏的红细胞（即红细胞表面均带有口蹄疫抗体），遇到相应的口蹄疫病毒抗原时，便产生抗原抗体的特异性反应，从而使红细胞发生肉眼可见的凝集现象。该法快速、简便、准确、可同步鉴定出口蹄疫毒型和鉴别口蹄疫、猪水泡病病原。1．试验材料V型96孔130o血凝滴定板、玻璃吸管（1毫升、5毫升规格）、玻璃中试管（内径15毫米，长度100毫米）、试管架、微量振荡器、微量移液器、塑料咀、玻璃板（与血凝板大小一致）、口蹄疫O、A、C、Asia-I型、SVD（猪水泡病）反向被动血凝诊断试剂及其配套用的口蹄疫各型、猪水泡病阳性抗原、阴性抗原、稀释液、待检抗原。２．试验方法（１）稀释待检抗原取中试管8支，横列于试管架上，每管各加入稀释液1毫升，取待检抗原1毫升加入第1管混匀后从中取出1毫升加入第2管，混匀后取1毫升加入第3管……直至第8管，此时待检抗原的稀释度依次为1：6、1：12、1：24、1：48、1：96、1：192、1：384、1：768。（２）稀释阴性抗原取中试管1支用记号笔标明“阴抗”字样，加入稀释液390微升，加入阴性抗原10微升，充分混匀，此时阴性抗原的稀释度为1：40。（３）稀释阳性抗原取中试管20支，横列于管架标明“阳抗”字样，每排4支，（O型4支、A型4支、C型4支、Asia-1型4支、SVD4支）。每种阳抗第1管，加稀释液4.7毫升，第2~4管各加稀释液0.5毫升。取O型阳性抗原0.1毫升(100微升)加入第1排的第1管中混匀后取出0.5毫升，加入第1排的第2管并充分混匀，取出0.5毫升加入第1排的第3管混匀后取出0.5毫升加入第1排的第4管并混匀。其他阳性抗原均按上法稀释，注意每稀释一种阳抗必须更换1支吸管，切勿混杂以免影响反应的特异性。经过上述稀释，各阳性抗原的稀释度依次为1：48、1：96、1：192和1：384。用于阳抗对照孔的只加第4管（1：384）的阳抗。（４）滴加待检抗原和对照抗原取第8管稀释的待检抗原（1：768）加入血凝滴定板上的1~5排的第8孔，每孔50微升，取第7管待检抗原（1：384）加入1~5排的第7孔，取第6管待检抗原（1：192）加入1~5排的第6孔……直至第1孔，每孔均为50微升。1~5排的第10孔加入1：40的阴性抗原，每孔50微升。1-5排的第11孔依次加入O、A、C、Asia-1型和SVD1：384稀释度的阳性抗原，每孔50微升（即第1排的第11孔加O型抗原；第2排的11孔加A型抗原；第3排的11孔加C型抗原；第4排的11孔加Asia–1型抗原；第5排的11孔加SVD抗原）。1-5排的第12孔各加稀释液50微升作为稀释液对照。（５）滴加反向被动血凝诊断液血凝板上的第1排1~8孔和10~12孔加O型诊断液，每孔25微升。第2排1~8孔和10~12孔加入A型诊断液，每孔25微升。第3排1~8孔和10~12孔加入C型诊断液，每孔25微升。第4排1~8孔和10~12孔加入Asia-1型诊断液，每孔25微升。第5排1~8孔和10~12孔加入SVD诊断液，每孔25微升。（６）振荡血凝板加毕诊断液后，立即将血凝板置于微量振荡器上，中速振荡30秒，取下血凝板放在白纸上观察各孔的红细胞是否均匀悬浮，孔底应无红细胞沉淀，若全部或部分孔底尚有红细胞沉积，应继续在振荡器上振荡，直至充分混匀为止。（７）室温下静置将混匀的血凝板，盖上玻璃板后静置2小时，判定检测结果，若对照孔红细胞沉降不清晰或因故来不及判定，也可静置第2天判定。３．判定标准先观察血凝板上1~5排的10~12孔，每排的第10孔为阴性抗原对照孔，应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成边缘整齐的小圆点；每排的11孔为阳性抗原对照孔，应出现“++”~“#”的凝集现象（即有50~100%红细胞发生凝集，红细胞悬于孔中，不沉入孔底），证明所加的反向诊断液效价不低于1：384，用于检测抗原合格；每排的第12孔为稀释液对照孔，也应无凝集现象，红细胞应全部沉入孔底，形成小圆点。在上述对照孔判定合格的前提下，仔细观察血凝板上的1~5排的1~8孔，某排1~8孔或1~6孔均有“++”~“#”凝集现象，而其余4排仅在1~2孔出现“+”~“++”的凝集，即可判定该份待检抗原为阳性。其型别与所加的反向诊断液的型别相同。比如第1排1~8孔出现“++”以上的红细胞凝集，第2~5排无此现象，便可判定该待检抗原为O型口蹄疫。以出现“++”以上凝集的待检抗原最大稀释度为其抗原滴度。例如第1排的1~4孔出现“#”凝集，第5孔出现“+++”凝集第6孔出现“++”凝集，第7孔出现“+”凝集，第8孔无凝集现象，即判定该待检抗原为O型，滴度为1：192（以第6孔出现“++”凝集为滴度的终点）。４．注意事项（１）勿用90o和110o血凝板，防止误判。（２）阴性抗原、阳性抗原和稀释液3孔对照全部或部分出现不合格时，检测结果不能判定，应更换试剂重新检测，以免错判。（３）严重腐败变质的病料不宜检测，以防非特异反应。（４）病料太少，无法检测时，可制成1：10或1：20悬液，先接种3~5日龄小白鼠，连传3代后，用鼠组织制成待检抗原，再进行检测。（５）检测过程中，有时出现前带现象，即第1孔或第2孔的红细胞沉淀形成小园点，第3孔以后又出现“++”以上的凝集，这是因为抗原抗体比例失调所致，不影响结果判定。反向被动红细胞凝集试验的诊断液及其配套试剂由中国农科院兰州兽医研究所供应。（二）口蹄疫微量补体结合试验补体的作用是无特异性的，它能与任何一组抗原抗体复合物结合并不再游离。但不能单独与抗原或抗体结合。当抗原与其相应的抗体结合成复合物之后，可与补体结合，但这种反应不能用肉眼观察。如果抗原是红细胞与其相应抗体（溶血素）形成复合物后，当有补体存在时，红细胞就发生溶血；如补体已被其他抗原抗体复合物结合，则不溶血。这种现象用肉眼是可以观察到的。因此利用溶血反应作为指示剂，以检验补体是否已被前一种抗原抗体系统所结合，这种试验叫做补体结合试验。前者称为溶菌系统或试验系统，后者称为溶血系统。如果溶菌系统的抗原抗体是相应的，则补体被结合，加入溶血系统后不发生溶血。反之，二者不对应，则补体游离，加入溶血系统后发生溶血。所以在补体结合试验中，溶血判为阴性；不溶血则判为阳性。操作步骤如下：１．测定溶血素效价（1）取试管10支列于管架上，1~10管内各加生理盐水0.5毫升（2）取溶血素0.2毫升加生理盐水9.8毫升=1:100的溶血素。（3）取1：100的溶血素1毫升加生理盐水4毫升=1：500溶血素。（4）取1：500的溶血素0.5毫升加入第1管混匀并取出0.5毫升加入第2管混匀，并取出0.5毫升加入第3管……以此类推，直至第8管。并取出0.5毫升弃去，1~8管的溶血素稀释度依次为1：1000~1：8000，第9、10管为对照管。（5）将补体（豚鼠血清）用生理盐水稀释成1：10，1~9管各加0.5毫升，第10管不加补体而加1：500的溶血素0.5毫升。（6）将洗净的红细胞沉淀用生理盐水配成2%浓度，1~10管各加0.5毫升。（7）每管充分混匀置37℃水浴中作用20分钟后判定效价。（8）以出现完全溶血的溶血素最大稀释度为其效价。溶血素效价滴定表（剂量毫升）试管号12345678910生理盐水0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.51：500溶血素0.5补体（1：10）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5(1:500溶血素)红细胞（2%）0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.537℃20分钟判定效价————++++++＃＃＃按此表滴度结果，该溶血素效价＝1：4000，工作浓度为效价的4倍即1：1000。1．测定补体效价溶血素效价被测出后，即可滴定补体效价。新鲜补体或冻干补体被稀释后，容易失效，宜用10%NaCl保存，即补体1份十10%Nacl1份，混合后置4℃或-20℃贮存有效期2~3个月。取保存补体2毫升加生理盐水8毫升=1：10的补体。按下表程序及剂量进行滴定。补体效价滴定表（剂量:毫升）试管号12345678生理盐水0.050.10.150.20.250.30.350.4补体（1：10）0.450.40.350.30.250.20.150.1溶血素（工0.50.50.50.50.50.50.50.5作浓度）红细胞（2%）0.50.50.50.50.50.50.50.537℃30分钟判定———++++++＃＃以出现完全溶血的补体最大稀释度为其效价。按此表测出的该补体效价为0.35，工作浓度为0.45。以上A和B两步骤称为预备试验，溶血素一般半年滴定一次。而补体则必须在每次试验前滴定，如果补体效价不准确，将会影响试验的结果。3．将标准血清（已知阳性血清）用生理盐水稀释成1：4（阴性血清1毫升加生理盐水3毫升）。标准血清的补反效价必须达到1：80以上）。4．在96孔或24孔U型微量滴定板上，1~5排的1~7孔，各滴2滴（约50微升）生理盐水，半小时后弃去，以防板孔对反应成分的非特异吸附。①将待检抗原稀释成1：3、1：6、1：12和1：24，分别滴入1~5排的1~4孔，每孔1滴（约25微升）。②第1-5排的第5孔滴入阴性抗原各1滴；1~5排的第6孔依次分别滴入O、A、C、Asia-I型和SVD阳性抗原1滴，1~5排的第7孔各滴入盐水1滴,作为阴性、阳性和盐水对照。③1~5排的1~4孔依次分别加入O、A、C、Asia-I型和SVD标准清1滴（25微升）。④1~5排的1~7孔各加补体工作浓度2滴（50微升）。⑤微量振荡器上振荡1分钟，37℃温箱保温40分钟。⑥每孔各加溶血素工作浓度1滴。⑦每孔各加2%红细胞1滴。⑧振荡器上振荡一分钟，37℃温箱30分钟后判定结果。5．判定标准：先检查对照孔，第5和第7孔应完全溶血为合格；第1~5排的第1~4孔中任一孔呈现不溶血则判该份待检抗原为阳性，其型别与所加标准血清的型别相同。该法操作较繁琐，敏感性低，但特异强。（三）口蹄疫酶联免疫吸附试验（ELISA）八十年代以来，国外常采用ELISA鉴定口蹄疫和猪水泡病病毒。国内也有人试用该法对FMDV和SDV进行检测，由于IgG的纯度不高，经常出现非特异性反应。影响检测的准确性，使推广应用受到限制。ELISA技术虽然多种多样，但一般以双抗体夹心法居多。用最适浓度抗口蹄疫血清的IgG包被酶标板孔4℃过夜，经洗涤后加入待检抗原37℃保温1小时，洗涤后再加辣根过氧化物酶标记的兔抗豚鼠血清的IgG37℃保温1小时，洗涤后加底物溶液（邻苯二胺和H2O2），30分钟后用2MH2SO4中止反应，751型分光光度计492nm测定光密值或在酶标检测仪上直接测定。阳性OD值为0.7~0.9；阴性OD值为0.1~0.3。（四）免疫荧光直接检检测口蹄疫带毒肉品的操作方法1．试验材料（1）荧光显微镜及自动照相装置1台（2）冰冻组织切片机1台（3）电热恒温箱1台（4）玻璃染色缸2具（5）玻璃片5盒（6）组织切片盒2个（7）抗体（O型、A型、Asia-I型、SVD等4种）（8）0.01MpH7.2~7.4的PBS（9）丙酮（10）伊文斯兰（万分之二浓度）2．操作方法（1）剥离淋巴结周围的脂肪及被膜，将淋巴结剪成长1.5~2cm,宽0.8~1cm厚0.3~0.5cm的组织块。（2）在冷冻组织切片机上，低温切成5~6微米的薄片，每份淋巴结切片8张，迅速粘贴在洁净的载玻片上，并用记号笔编号。（3）冷丙酮固定（室温下20分钟或在4℃下30分钟）。（4）0.01MpH7.2~7.4PBS漂洗3次，每次1分钟，用滤纸吸去样品周围水份，切勿碰损样品，再用吹风机吹干样品。（5）滴加荧光抗体工作液，以复盖样品为度，置温盒37℃温箱保温30分钟。（6）PBS洗3次，滤纸吸水并吹干。（7）荧光显微镜下观察。3．判定标准（1）先判定已知阴性淋巴结切片染色结果，仅见组织