光学显微镜.

生物光镜标本技术南通大学医学院组织学与胚胎学系王晓冬2015年3月E-mail:[e-mail]；QQ:455606752电话：0513-8505186213773659801江苏省优秀研究生课程目的不同层次的研究方法（整体、器官、组织、细胞、分子）不同学科的研究方法（形态、机能）生物光镜技术是生物医学研究中最常用手段之一《生物光镜标本技术》希望能给大家对生物光镜标本技术涉及的范围和常用的技术方法有个初步了解，并对今后研究工作有所帮助内容光学显微镜光镜标本基本制作技术光镜标本特殊染色技术光镜标本组织化学技术光镜标本免疫组织化学技术光镜标本杂交组织化学技术光镜标本显微摄影技术光镜标本显微图像处理与分析技术第一章光学显微镜光学显微镜是观察生物有机体的微细结构、组织和细胞内的物质分布及有关细胞功能活动的精密仪器显微镜的发展历史及应用成果荷兰人（ZachariasJanssen）（1595年）发明第一台复式显微镜？英国人RobertHook（1665年）第一次用最简单的显微镜观察生物样品—软木切片，发现了一些锋窝样空腔结构，并命名为“细胞”德国植物学家Schleiden（1838年）和动物学家Schwann（1839年）分别发现植物和动物都是由细胞组成，建立了“细胞学说”德国病理学家Virchow（1856年）进一步提出细胞是机体的结构和功能单位显微镜的种类普通光学显微镜相差显微镜激光扫描共聚焦显微镜偏光显微镜多光子显微镜原子力显微镜倒置显微镜荧光显微镜暗视野显微镜微分干涉显微镜扫描遂道显微镜电子显微镜一、普通光学显微镜的原理及性能第一节普通光学显微镜二、普通光学显微镜的结构(一)机械部分(二)光学部分数值孔径（N.A）为物镜从物体吸收的光量，取决于物体点到镜面边缘入射光束与物镜光轴之间形成的角度（u）和光线通过介质的折射率（n）三、光学显微镜技术指标N.A=n*sinu物镜分辨率（Z）是指能分辨物体两点间最短距离的能力，与光波波长（λ）和数值孔径（N.A）的关系Z=0.61λ/N.A可见光波波长平均为550nm，数值孔径一般小于1，最大数值孔径为1.4，所以光镜最高分辨率约为0.25μm新的理论及技术使光学显微镜能超高分辨率！~1nmDr~200nm衍射极限光点物镜激发的荧光光镜荧光图像分辨率受到衍射极限限制放大率指最终成像与原物体的大小比值总放大率=物镜线放大率×目镜角放大率放大率受物镜分辨率的限制景深（将焦点调在标本上的某一平面时，能看清楚这一平面及其上下结构的清晰部分的厚度）视野范围视野亮度四、光学显微镜照明技术透射式照明落射式照明五、光学显微镜使用和保养第二节倒置显微镜倒置显微镜把光源和聚光器安装在显微镜载物台的上方，物镜放置在载物台的下方配有附件：相差长焦距聚光器和物镜、暗视野聚光器、荧光显微镜光源和滤片（激发滤片和阻断滤片）以及电影摄像机等显微镜特点：增大了物镜和聚光器的工作距离，载物台可放置较高的标本，如培养皿或培养瓶，还可以安装有机玻璃保温罩和自动恒温调节器，直接观察体外培养的细胞，以及对活细胞进行各种实验操作及连续观察和拍摄电影第三节相差显微镜相差显微镜是利用光的干涉和衍射作用，使不染色标本中不同折光的部分变成明暗相差的图像，因此可适用于观察体外培养的活细胞形态结构及分裂增生和运动变化、染色标本中染色所不能显示的微细结构等一、相差显微镜成像原理基本原理涉及两个问题：光波的相位差和光的干涉与衍射相差显微镜的特点是改变光的相位，使相位差变为振幅差，借此增强或减弱光的明暗度而观察生活标本的微细结构二、相差显微镜装置增加部件：环状光栏、相位板和中心望远镜环状光栏随物镜放大倍数的高低变更其大小，常将不同的（10×、20×、40×、100×）环状光栏与聚光器装在一起组成转盘聚光器，转动聚光器可更换大小不同的光栏。数字为“0”时，表明无环状光栏，为普通明视野观察孔第四节荧光显微镜荧光显微镜的主要特点是观察的标本图像，不是由于光源照明成像的结果，而是由于标本内的荧光物质吸收光源而发出的激发光光能，所呈现的荧光现象，如果停止照明（停止供能），则荧光现象立即消失一、荧光的产生光的实质上是物质的原子或分子向外辐射的一种可见的电磁波当光进入某些物质后，部分或全部光能可被此物质的分子或原子吸收物质从外部吸收光能后，会进入新的状态，称为“激发态”。而激发态属于不稳定状态，所以物质会从激发态回到原来的基态，以电磁辐射的形式放出所吸收的能量，这种现象叫做“发光”荧光也是一种光致发光的现象释放出的荧光波长较激发光的长，如引起荧光的最有效的光常是激光、紫外光和蓝紫光，而产生的是红、橙、黄、绿、青、蓝、紫色的荧光荧光分自发性荧光（原发荧光、固有荧光或自然荧光）和续发性荧光二、荧光显微镜组成（一）光源荧光显微镜均附有高压汞灯和低压钨丝或卤素灯两种光源。前者为荧光显微镜光源，后者为进行普通标本观察时的照明光源（二）滤片系统（三）显微镜EthidiumPETexasRedPIFITC600nm500nm400nm457350514610488ExcitingLightFluroescence激发滤片装在光源和标本之间的滤片滑板中，其作用是吸收光源中波长较长的可见光，允许短于一定波长的光波通过，作为荧光显微镜的激发光阻断滤片是装在物镜和目镜之间的光路滑板中。吸收短于滤片标记数字的波长光，允许长于标记数字的波长光通过。它的主要作用是吸收视野内未被标本吸收的激发光，允许标本内的物质发射的荧光通过，以获得清晰的荧光图像和保护观察者的眼睛吸热滤片吸收紫外线滤片激发滤片和阻断滤片的联合使用激发滤片及激发波长阻断滤片最适宜的荧光染色和自发荧光UV（365nm）紫外线410W樱草素、硫代黄素荧光染色V（410~420nm）紫光460W单胺（去甲肾上腺素、多巴、5—羟色胺）自发荧光BV（404~435nm）蓝紫光515W~530W吖啶橙荧光染色B（490nm）蓝光515W免疫荧光染色（FITC），芥子奎纳克林、金胺荧光染色G（520~550nm）青光580W免疫荧光染色（TRITC）和Feulgen反应荧光染色三、荧光素四、荧光显微镜主要用途（一）组织细胞的自发性荧光（二）荧光染色法（续发性荧光）（三）免疫荧光染色法和荧光杂交染色五、荧光显微镜使用的主要注意事项1.启动高压汞灯后，需经5~15分钟预热，达到最大亮度，再观察标本2.每次使用高压汞灯以1~2小时为宜，观察途中不要随意开关电源；关闭电源后，不得立即开启。汞灯寿命约为200小时，所以标本尽量集中观察、摄影，以节省时间3.载玻片厚度应在0.8~1.2mm之间，盖玻片厚度在0.17mm左右，标本不宜太厚4.标本荧光染色后应立即进行观察；观察时，不要在同一部位停留时间太长，以免荧光淬灭，最好在稍加观察后即显微摄影，然后再仔细观察第五节激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜是一种高光敏度、高分辨率、荧光检测信噪比更好的新型生物学仪器。可对活细胞分层扫描，进行三维重建和测量分析；同时对细胞内微细结构的动态变化进行定位、定性和定量分析检测；运用荧光标记可对细胞内离子浓度的动态变化及变化比例进行分析主要由激光光源、共聚焦成像扫描系统、电子光学系统和计算机图像分析系统4部分组成一、激光扫描共聚焦显微镜工作原理激光扫描共聚焦显微镜的光源是激光，如氩离子、氪氩和氦氖等激光管产生。激光束通过入射针孔被聚焦成束斑落在样品的某一平面上，避免了非照射区域发生光散射，同时通过机械式对样品进行四维扫描；样品在被扫描时，产生反射的激光束或荧光，由原来的入射光路直接回到光束分散器，并经过在探测器的前方于焦点水平面的检测针孔及聚焦透镜到达探测器内。后者通过光电效应把光信号转换成电信号，最后传递到彩色显示器上，和进入计算机图像分析系统，对图像进行二维或三维的分析处理等由于入射针孔和检测针孔的位置相对于物镜焦平面是共轭、并几何尺寸一致；即光点通过一系列透镜，最终可同时聚焦于两针孔，这就是“共聚焦”的含义所在。经过这样的作用使样本中高于或低于聚焦平面的反射光和杂散光均被遮擦掉，从而提高图像的分辨率，使图像的质量更清晰荧光显微镜汞灯发射滤片激发光圈目镜激光光源发射针孔激发针孔PMT发射滤片激发滤片激光扫描共聚焦显微镜物镜物镜激发滤片显微镜：倒置研究级全自动生物显微镜配正置、倒置物镜各一套；恒温、二氧化碳培养系统；显微摄影数码相机激光光源：紫外激光器UV351/364nm；Red（HeNe633nm/10mw）；Green（HeNe543nm/1.2mw）;Blue（Ar458nm/5mw；476nm/5mw；488nm/20mw；514nm/20mw）HP-P42.0工作站内存1.0G，光盘刻录机；Control、3D、Physiology软件；LeicaTCS-SP2激光扫描共聚焦显微镜二、激光扫描共聚焦显微镜技术性能（一）分辨率高：是普通显微镜的1.4~3倍（二）灵敏度高：可检测极弱的荧光（三）扫描方式多、扫描速度快（四）扫描范围大：2cm×2cm（五）图像质量高并存取方便（六）光切片和细胞CT：最薄平面间隔为600~800nm，可观察片厚达0.5~1mm的标本（七）对细胞物质和结构的荧光能进行定位、定性和定量分析检测TheUVandVisibleSpectrum(HumanSight)蛋白质标记用荧光探针•FITC488525•PE488575•APC630650•PerCP™488680•CascadeBlue360450•Coumerin-phalloidin350450•TexasRed™610630•Tetramethylrhodamine-amines550575•CY3(indotrimethinecyanines)540575•CY5(indopentamethinecyanines)640670探针激发波长发射波长•Hoechst33342(ATrich)(uv)346460•DAPI(uv)359461•POPO-1434456•YOYO-1491509•AcridineOrange(RNA)460650•AcridineOrange(DNA)502536•ThiazoleOrange(vis)509525•TOTO-1514533•EthidiumBromide526604•PI(uv/vis)536620•7-AminoactinomycinD(7AAD)555655核酸标记探针探针激发波长发射波长离子标记探针•INDO-1350405/480•QUIN-2350490•Fluo-3488525•Fura-2330/360510探针激发波长发射波长pH敏感荧光探针•SNARF-1488575•BCECF488525/620440/488525[2’,7’-bis-(carboxyethyl)-5,6-carboxyfluorescein]探针激发波长发射波长细胞器荧光探针•BODIPYGolgi505511•NBDGolgi488525•DPHLipid350420•TMA-DPHLipid350420•JC-1Mitochondria490527/590•Rhodamine123Mitochondria488525•DiOLipid488500•diI-Cn-(5)Lipid550565•diO-Cn-(3)Lipid488500探针激发波长发射波长其它•GFP-GreenFluorescentProtein•YFP-YellowFluorescentProtein–GFP、YFParefromthechemiluminescentjellyfishAequoreavictoria–excitationmaximaat395and470nm(quantumefficiencyis0.8)Peakemissionat509nm–Majorapplicationisasareportergeneforassayofpromoteractivity–require