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单粒子多通道的生物气溶胶荧光传感器一、研究背景过去的十年，环境可以被连续监测到存在潜在的有害生物气溶胶,在这些搜寻方法中，颗粒荧光方法已经得到了相当的关注。当包含生物有机体的主要生物荧光基团被射线激活时，内部粒子荧光可以用来帮助区分生物与非生物粒子，甚至可以提供生物颗粒间的差别，这些粒子是环境中的正常成分，而且可能会被认为是一种威胁。然而，由于来自生物荧光基团的荧光通常很微弱，在空气中的生物荧光基团数量很少，所以激活射线必须很强烈，而且激光器必须以这个目的来使用。比如在早前的系统中，多采用连续波激光器，尽管这些激光器体积大易碎，而且只针对重要的生物荧光基团的有效激发下产生的较长波长起作用，像色氨酸，最优应激出现在260—280nm波长范围内。因此，大量用于谐波分析的固体激光器获得广泛认可，比如四倍频的Nd-YAG激光器，同时拥有266nm的输出波长和比连续波气体激光器更小的波形因数。二、激光激发荧光系统（LIF）这些发现已经开始发掘LIF对于描述空气粒子和病原体的潜力。然而，固体调谐激光器各组成部分相对昂贵，系统中还要求多点检测和大范围追踪。因此，目前要在结构小巧和能量大并且能连续发出低于300nm波长的半导体光源发展上做很大的努力。特别是开始于2002年的美国SUVOS（半导体紫外光源）计划，正在这个目标上有巨大收获，已经证实原始LED装置能够在毫瓦功率级发射280nm室温连续波。这些装置已经在生物传感器试验台进行了组装。过去的十年中，从现有已开发的粒子LIF系统公布的结果看，针对令人满意的繁衍和典型的个体生物粒子LIF记录，允许一个“荧光测定和捕获”的近似下限。这表明，一般情况下，粒子必须经过能量密度大于200-300μJ/cm2紫外激光照射，在获得的信号中，粒子每个球面度的荧光角能采集到足够的信噪比。在要求光谱信息具有高分辨率的场合下，能量密度必须按比例增加；例如，潘永乐[8]介绍了一种具有超过100个记录通道的荧光光谱仪，该种光谱仪所用的紫外激光能量密度为3×104μJ/cm2。就如同在毫秒级的时间内从Q调制固体激光器，或者像紫外发光二极管这样的连续波低功率源作用一样，我们要求紫外激光能量在几十纳秒的时间内传送给粒子。然而，在后一种情况，长时间保持聚焦的紫外线照射单一粒子存在问题（难度），而且这也违背整体气溶胶样品体积流量的原理。因此，尽管紫外发光二极管和极紫外二极管激光器为实际生物气溶胶荧光传感器提供了较好的前景，但在它们可以被纳入商业领域的检测系统之前，设备的输出功率和寿命必须增加。直到这种设备经常使用，替代低成本高功率的紫外光源满足需求才不那么迫切，才能满足以荧光为基础的生物气溶胶传感器在军事和民用场景的需求。微型氙闪光灯代表这样的更替，它有传递紫外激光能量到粒子的能力，并且作为宽带光源，它还为用于生物荧光最佳激发波长提供了选择。本文介绍了一种紧凑的低成本的原型气溶胶荧光传感器，采用两个这样的氙闪光灯记录两通道荧光数据，这两道荧光来自大小为1μm单个空气粒子，粒子速度可达7500个/分钟。三、单颗粒气溶胶荧光传感器，WIBS2这个系统原型是在双氙气宽光源生物传感器基础上描述的。双氙气宽光源生物传感器记录了许多来自体积在几个立方厘米的大样本中的粒子荧光辐射，它利用了光学过滤的氙气光源的周期性闪烁。像这样，同时多粒子照明大大简化了机械气流系统和光学检测系统，使整体传感器的成本非常低。但是，多个粒子同时激励会不可避免地导致荧光数据平均结果超过所有的粒子，虽然这对大致均匀的气溶胶无太大影响，但它损害了传感器区分低浓度有害生物粒子对较高浓度的背景颗粒的能力。单个粒子的检测需要避免此类情况。1、WIBS2的运行概况新型单粒子荧光传感器WIBS2采用一个中心光学腔，腔周围设有一个用于检测和分选颗粒（见2.4节）的660nm连续波长二极管激光器，两个在不同波段（见2.3节）发射脉冲的氙气紫外线光源，和两个荧光检测通道FL1和FL2（这两个通道用于两个波段的粒子的荧光检测）。因此，对每一个粒子来说，其大小的估计都用一个2x2的激发发射矩阵记录。图1WIBS2传感器的示意图和传感器实体，约（26x22x28）厘米大小在操作中，气溶胶是从周围的气体通过层流输送系统引入的。当粒子在中心腔从二极管激光器穿过聚焦光束时，层流输送系统使悬浮颗粒基本上成单层排列。气溶胶总流量为4.5升/分钟，在注入新气溶胶流前，其中一部分以3.9升/分钟缓缓通过，形成一个鞘流限制剩余样品流过。气溶胶样品流和激光束的交叉点确定散射体（直径0.8mm气溶胶流散射体荧光辐射捕捉连续激光束和深度130μm），如图1所示。进入激光束的粒子会产生散射光信号，从散射信号的量级，粒子（球形物）尺寸可由Mie理论确定。图2氙气光脉冲叠加在散射体上的横截面（虚线椭圆）图2显示了散射体（虚线椭圆），从氙气光源1看：以30°角向下观察水平面，粒子检测之后照射10μs（对粒度进行评估所需的时间），此时粒子已经移动了180μm到达水平面，也就是散射体的下面。XE1输出是有目的的，最高能量密度区域包括被黑色椭圆划定的粒子目标区。第二个氙气光源XE2随后照射6μs，以低于第一个光源的速度保证这段时间内额外粒子的运动。交叉点处的粒子目标区域，从每个氙灯发出的紫外辐射脉冲约2mm×1mm的面面积（见图2），以基本均匀的超过300μJ/cm2的能量照亮整个散射体。因此，不管粒子从哪儿穿过这个区域，当比较不同粒子的荧光性质时，应当考虑经过类似的紫外应激的影响（6%之内）。WIBS2采用两个滨松L9455氙模块（日本滨松光子学株式会社）。这些都是紧凑型（10×4×3.5cm）外部触发模块，模块中包括一个精度为1.5毫米弧长的氙气放电管。闪光能量的再生性能在±3%是较好的（虽然在WIBS2中每个放电管都进行了测量和对变化的校正）。氙源以最大放电能量40MJ和闪光持续时间1s进行工作。在最大闪光能量下工作时，氙最高重复频率为126Hz，限制它的散热功率为5W。以其目前0.6L/min的采样流量，WIBS2能够对粒子浓度高1.3×10／L的粒子激发荧光。超了这个浓度，额外的颗粒只能被计数和测量。氙灯输出随脉冲次数缓慢下降，在1.5×109脉冲后下降到75%，相当于在126Hz的最大放电率下连续运行3000小时。2、荧光采集由两氙紫外脉冲激发的粒子固有荧光发射通过检测通道FL1和FL2收集。每个通道包括直径51mm的光阑、焦距为17.5mm的球面镜，反映了荧光灯发出粒子穿过腔室到一个完全相同的相对反射镜的孔中，如图3ZEMAX射线所示。因此，每个镜子能收集荧光发出超过3.1sr的立体角，并通过一个带通滤波器引导粒子到达小型光电倍增管（PMT）模块的光电阴极。这个系统的设计是这样的：PMT的视场被限制在一个直径2mm的小圆圈内，它包括散射体和散射体正下方的粒子目标区域。这减少了光电倍增管接收多余的荧粒子。图3一种荧光检测通道（如虚线所示的第二通道反射镜）的射线图3、荧光激发和发射带第一个氙灯的输出使用了自定义的紫外带通滤波器进行光学滤波。280nm峰值波长（如图4）激发的结果和色氨酸生物荧光基团的吸收峰很符合。第二个氙灯使用了自带的现成的滤波器进行滤波，产生一个370nm的峰值（如图4），很接近另一种重要生物荧光基团的最大吸收峰。第一个荧光检测通道FL1，要求检测正好与色氨酸的荧光光谱最大值重合的荧光，即：大约在300-420nm之间，峰值在345nm处。一个在330nm处具有50%的透射率的自定义长通光学滤波器最初就是为了这个目的开发使用的。当结合光电倍增管的光电阴极响应时，检测带可从320nm延伸至600nm，如图5所示。图4wibs2氙气光源的光谱输出XE1和XE2第二个检测通道FL2，针对的是NADH的发射带，即：在400-600nm之间，峰值在450nm。这个波段的定义是使用一个标准的KV418滤波器实现的，这个高通滤波器具有尖锐的截止波长和极低的内荧光效率。再次，该滤波器的透射率和光电倍增管光电阴极的有效结合定义了所需的带宽，如图5。虽然FL1带宽远远超出主色氨酸在420nm的发射峰的上限，但这种传输和包括大多数的色氨酸辐射的FL2通道之间是不同的。（注意，尽管在本文中用过滤器记录了实验数据，但一个新的在310nm具有50%的透过率的长通滤波器不久将取代FL1通道中的DUV2长通滤波器。这将在有效捕捉短波长的色氨酸荧光发射峰的改进上提高40%）。图5FL1（左）和FL2（右）荧光检测。在每一种情况下，虚线表示PMT检测器的响应，短划线表示滤波器，和实线表示产生的荧光带4、粒子探测正如上面提到的，当一个粒子进入散射体后，通过从连续波二极管激光束发出的光弹性散射，粒子可以被探测到。为了方便和进一步降低传感器成本，这种散射光检测也由FL2通道实现了荧光检测。如图5显示，用于FL2通道的光电倍增管检测器有一个迅速下降到600nm波长的响应。在660nm波长的激光器中，PMT响应是波长400nm时峰值下降一千倍的一个因素。很偶然的情况下，粒子弹性散射的幅度也是类似于粒子荧光的一个因素，这使得弹性散射和FL2荧光脉冲必须使用相同的PMT增益设置才能成功记录。通过这种方式测出的粒子尺寸只是近似的，因为被FL2探测器接收到的散射光幅度是粒子形状、折射率以及大小的函数。5、数据采集获取颗粒尺寸和荧光数据这样的周期大约需要25秒。图6显示当一个直径3m的聚苯乙烯乳胶球通过散射体时，从检测器通道FL1和FL2信号的示波器波形。当颗粒进入激光束时，FL2通道（靠上的轨迹）记录的是弹性散射信号的幅度，编号为（1），为负向信号。由于FL1通道增益设置低于FL2，但在一个较小的幅度，FL1的轨迹也检测到这种散射光信号。图6由于3μm大的PSL球体通过散射体后，FL1和FL2检测器信号的一个例子（见文本说明编号）粒子探测后10μs，XE1氙灯开始照射，用280nm的紫外线辐射粒子，产生荧光信号（2）和（3），分别从通道FL2和FL1获得。这个过程之后6μs，XE2氙灯开始照射，用370nm波长的紫外辐射照射的粒子。通道FL2记录波长带宽在420-600nm的粒子发出的信号（4）。但是，氙灯2的辐射范围位于通道FL1的带宽之内，因此本通道光电倍增管（PMT）可接收到弹性散射粒子。波长370nm辐射产生的弹性散射幅度远远高于其产生荧光信号幅度，而且足以使FL1通道检测放大器在顷刻间达到饱和。这种饱和信号脉冲（5）不可用。从饱和恢复到放大状态需要10μs。信号（1）、（2）、（3）、（4）在被传递到主机处理器之前，集中综合他们的宽度，数字化综合值精度达到12位。该系统现在已经准备好探测更深层的粒子。然而，由于氙气光源需要约5ms重新充电，在这5ms的时间内经过散射体的任何颗粒可以记录测量，但没有获得荧光数据。6、数据处理每个粒子的荧光数据记录必须作下列修正：（1）、背景补偿：被FL1和FL2检测到的信号补偿由散射腔中紫外线激发的低能量荧光和阻带滤波中很小的有限透射比产生的滤波突破引起。在散射体中无粒子无样品流动条件下，当氙灯1和氙灯2被迫发光时，这些偏移量的大小取决于测量的FL1和FL2通道响应。（2）、紫外脉冲能量的微小变化和长期衰减。从采用紫外敏感的光电二极管的XE1和XE2记录每个紫外脉冲幅度。（3）、荧光过滤（筛选）。FL1和FL2通道的光滤波器被粒子和荧光灯产生的弹性散射紫外线轰击。对于足够高的幅度的散射紫外线，能产生荧光过滤器可检测的电位。通过记录石英或氯化钠这样非荧光颗粒产生的清晰荧光，来校正这种效应。以下数据已根据上述误差来源进行更正。四、初步实验数据表1WIBS2数据分析记录将表1罗列的三种荧光度量法和粒子尺寸、粒子数密度结合起来，就有很多潜在的方法。虽然下面简单的图形显示了一些信息，但其他基础方法，比如人工神经网络分析，更适合自动化决策，而且对于DSTL，我们的合著者也在努力。图7显示了一些常见的荧光和非荧光材料的各种测试气溶胶的结果，材料的选择有助于实现WIBS2粒子鉴别。在100L的镇流器箱内使