免疫共沉淀

整理文档很辛苦,赏杯茶钱您下走!

免费阅读已结束,点击下载阅读编辑剩下 ...

阅读已结束,您可以下载文档离线阅读编辑

资源描述

1.免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP):A.蛋白样品的准备:A1.对于10厘米细胞培养皿中的贴壁细胞,吸除细胞培养液,PBS洗涤一次,然后加入500微升至2毫升细胞裂解液裂解细胞。可以使用碧云天生产的Western及IP细胞裂解液(P0013)或各种RIPA裂解液(P0013B、P0013C、P0013D或P0013E)等进行细胞的裂解。A2.对于组织样品参考贴壁细胞使用裂解液的比例进行裂解。A3.对于悬浮细胞,离心收集细胞后,PBS洗涤一次,然后参考贴壁细胞的裂解方法进行裂解。注:详细的裂解方法参考不同裂解液的详细使用方法。对于不同的培养器材,参考10厘米培养皿的裂解液的用量进行裂解。如果裂解获得的蛋白样品浓度过高,可以用裂解液或PBS适当稀释,如果蛋白样品浓度过低,在以后的裂解过程中宜适当减少裂解液的用量。B.去除非特异性结合(可选做):B1.取200微升至1毫升蛋白样品,蛋白量约为200微克至1毫克,加入约1微克和免疫沉淀时使用的IgG种属相同的普通IgG和20微升充分重悬的ProteinGAgarose,4℃缓慢摇动30分钟至2小时。B2.2500rpm(约1000g)离心5分钟,取上清用于后续的免疫沉淀。注:所谓种属相同的IgG是指,例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG,则在本步骤中可以加入normalmouseIgG,如无normalIgG可以加入其它不影响后续检测的其它mouseIgG类型的抗体。通过和normalIgG和ProteinGAgarose的孵育,可以充分降低非特异性的结合,降低背景。C.免疫沉淀:C1.加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗,4℃缓慢摇动过夜。C2.再加入20微升充分重悬的ProteinGAgarose,4℃缓慢摇动1-3个小时。(为方便后续的洗涤操作可以把加入充分重悬的ProteinGAgarose的量调整为40微升。)C3.2500rpm(约1000g)离心5分钟,或瞬时高速离心,小心吸除上清,注意宁可留下少量上清也不能吸掉ProteinGAgarose。C4.用准备蛋白样品时的裂解液或PBS洗涤沉淀5次,裂解液或PBS的用量每次为0.5-1毫升。洗涤时离心条件和吸除上清的要求同上面的步骤C3。C5.完成最后一次洗涤后,去除上清,加入20-40微升1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液Vortex重悬沉淀,瞬时高速离心把样品离心至管底。C6.100℃或沸水浴处理3-5分钟,取部分或全部样品用于SDS-PAGE电泳,暂时不用的样品可以-20℃保存。2.免疫共沉淀:参考免疫沉淀的方法进行,但免疫共沉淀(co-IP)通常必须使用未经冻存的新鲜蛋白样品。普通的免疫沉淀虽然可以使用冻存的蛋白样品,但也宜用新鲜的蛋白样品为佳。免疫共沉淀一原理:IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“proreinA特异性地结合到免疫球蛋白的FC片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的beads上,使之与含有抗原的溶液及抗体反应后,beads上的proreinA就能吸附抗原达到精制的目的。实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同,免染能结合未必能用在IP反应。建议仔细检查抗体的说明书。特别是多抗的特异性是问题。其次,要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白,特别是骨架蛋白,缓冲液必须要使其溶解。为此,必须使用含有强界面活性剂的缓冲液,尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面,如用弱界面活性剂溶解细胞,就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结果,抗原决定族被封闭,影响与抗体的结合,即使IP成功,也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。再次,为防止蛋白的分解,修饰,溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂,低温下进行实验。每次实验之前,首先考虑抗体/缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原,过多则就不能沉降在beads上,残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原,过多则抗原被稀释。欲速则不达,确定好比例很必要。二准备:器械#微量高速冷冻离心机#移液枪#旋转盘#电泳设备#vortex震荡器#液氮及组织粉碎器#eppentube试剂#细胞或组织#蛋白定量kit#SDS电泳试剂#抗体(单抗时选择proteinG,二抗选择抗鼠Ig兔血清)#PBS#NaN3#proteinAsapharose试剂配制抗原蛋白溶解缓冲液1.RIPA缓冲液(最终浓度)1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)5MNacl15ml(150mM)0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)20%TritonX-10025ml(1%)10%DOC50ml(1%)10%SDS5ml(o.1%)TLCK18.5mg(0.1mM)TPCK35mg(0.2mM)DDW395mltoal500ml另外,使用之前加1mMPMSF(PMSF溶在酒精,浓度100mM,-20度遮光保存。注意不易溶于水)2.NP40lysis缓冲液1MTris-HCL(PH7.4)5ml(10mM)5MNacl15ml(150mM)0.5MEDTA(PH7.4)5ml(5mM)20%NP4025ml(1%)TLCK18.5mg(0.1mM)TPCK35mg(0.2mM)DDW450mltoal500ml使用前加1mM的PMSF注意点:*Tris缓冲剂PH随温度变化,高浓度盐酸滴定时发热,冷却后PH增高。*反复使用PMSF要注意保管方法。*1和2的缓冲剂的区别在于界面活性剂。TritonX-100,NP40是非离子界面活性剂,作用温和,,DOCSDS是离子性的强活性剂。注意忘记加TritonX-100,只加DOC,SDS,可能使抗体完全失去活性。1的蛋白变性效果强,可能损害抗原/抗体结合,2的作用温和,却可能造成抗原溶解不全。*两方都有EDTA,对抗原而言,二价离子Mg,Ca等是必要的。根据自己需要调节。EDTA用NaOH滴定。Protocol1调制proteinAsapharoseproteinAsapharose5ml溶于20ml含0.02%NaN3的PBS离心2000转2分,去上清,在沉淀加0.02%NaN3的PBS,离心后去上清,重复2次,最后沉淀加20ml含0.02%NaN3的PBS,冷藏保存用单抗做一抗时,把proteinAsapharose先用抗鼠Ig兔血清处理(每50ulproteinAsapharose用1-5ul血清)。旋转1-2h,混匀后,再离心1-2s去上清后,加PBS,vortex混合,离心去上清,重复二次加含0.02%NaN3的PBS到原来体积,冷存。避免长期保存。2.抗原的检出以下操作全在冰面或4度进行去除细胞培养液,用冷PBS洗一次。加RIPA,溶解后,转移到eppentube中用vortex混匀。RIPA的量:6cm的培养皿加1ml(蛋白质的量为500mg/ml),组织块用液氮粉碎,在缓冲剂中捣匀,蛋白定量。30m,15000rpm离心,上清转移到新tube。不用移液枪,直接从tube倒进另一个tube往上清加抗体,1ml加2-5ul抗体,冷室内旋转混匀1h加proteinAsapharose50ul,再混匀1h5000rpm离心1s,使sapharose沉淀,去上清。往sapharose加RIPA,vortex混匀,离心,去上清。重复4次洗净。加电泳用sample缓冲液40ul,2m煮沸,泳动后,固定/干燥胶,现像。3.注意点A:不熟练使用移液枪,会混入沉淀的不溶性蛋白,使实验失败。对无论怎么也除不去的混入蛋白,只使用上清的上半部,或用超速离心机。B:对电泳的非特异条带,最后可依次用含300mM,1omMNaCl的RIPA洗净各一次。(完)阅读全文(5393)/评论(10)/给紫晓留言/扔小纸条/文件夹:医学知识收藏:QQ书签del.icio.us/订阅:Google抓虾免疫共沉淀技术路线准备工作:预冷PBS,RIPABuffer,细胞刮子(用保鲜膜包好后,埋冰下),离心机1.用预冷的PBS洗涤细胞两次,最后一次吸干PBS;2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶,0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下,把悬液转到1.5EP管中,4℃,缓慢晃动15min(EP管插冰上,置水平摇床上)4.4℃,14000g离心15min,立即将上清转移到一个新的离心管中5.准备ProteinAagarose,用PBS洗两遍珠子,然后用PBS配制成50%浓度,建议减掉枪尖部分,避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6.每1ml总蛋白中加入100μlProteinA琼脂糖珠(50%),4℃摇晃10min(EP管插冰上,置水平摇床上),以去除非特异性杂蛋白,降低背景7.4℃,14000g离心15min,将上清转移到一个新的离心管中,去除ProteinA珠子8.(Bradford法)做蛋白标准曲线,测定蛋白浓度,测前将总蛋白至少稀释1:10倍以上,以减少细胞裂解液中去垢剂的影响(定量,分装后,可以在-20℃保存一个月)9.用PBS将总蛋白稀释到约1μg/μl,以降低裂解液中去垢剂的浓度,如果兴趣蛋白在细胞中含量较低,则总蛋白浓度应该稍高(如10μg/μl)10.加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中,抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11.4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2h室温孵育12.加入100μlProteinA琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物,4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温1h,如果所用抗体为鼠抗或鸡抗,建议加2μl“过渡抗体”(兔抗鼠IgG,兔抗鸡IgG)13.14000rpm瞬时离心5s,收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物,去上清,用预冷的RIPAbuffer洗3遍,800μl/遍,RIPAbuffer有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合,可以使用PBS14.用60μl2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起,轻轻混匀,缓冲液的量依据上样多少的需要而定(60μl足够上三道)15.将上样样品煮5min,以游离抗原,抗体,珠子,离心,将上清电泳,收集剩余琼脂糖珠,上清也可以暂时冻-20℃,留待以后电泳,电泳前应再次煮5min变性。RIPABuffer配制:基础成分:Tris-HCl(缓冲液成分,防止蛋白变性)NaCl(盐份,防止非特异蛋白聚集)NP-40(非离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液)去氧胆酸钠(离子去污剂,提取蛋白;用H2O配制成10%储存液;避光保存)注意:准备激酶(致活酶)实验时,不要加去氧胆酸钠,因为离子型去污剂能够使酶变性,导致活性丧失。RIPA蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)(用异丙醇配制成200mM的储存液,室温保存)EDTA(钙螯合剂;用H2O配制成100mM的储存液,PH7.4)亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)胃蛋白酶抑制剂(Pepstatin)(用甲醇配制成1mg/ml的储存液,分装,-20℃保存)RIPA磷酸(酯)酶抑制剂激活的Na3VO4(用H2O配制成200mM的储存液,见SodiumOrthovanadateActivationProtoco)NaF(200mM的储存液,室温保存)注意:在准备做磷酸(酯)酶实验的时候,不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制:配制100ml的modifiedRIPAbuffe:1.称取790mg的Tris-Base,加到75ml去离子水中,加入900mg的NaCl,搅拌,直到全部溶解,用HCl调节PH值到7.42.加10ml10%的NP-403.加2.5ml10%的去氧胆酸钠,搅拌,直到溶液澄清4.加1ml100mM的

1 / 10
下载文档,编辑使用

©2015-2020 m.777doc.com 三七文档.

备案号:鲁ICP备2024069028号-1 客服联系 QQ:2149211541

×
保存成功