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在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA，需要与沉淀后的样品DNA一起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据Input中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，按照取样比例换算出ChIP的效率，所以Input对照是ChIP实验必不可少的步骤。1.1.1免疫沉淀1）蛋白提取（1）取10盘长满10cm大皿的HepG2细胞，弃去培养基，用预冷PBS清洗细胞3次，吸净PBS残液。（2）加预冷的裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂）至培养皿中（每皿500-1000ul），冰上孵育30min。（3）用细胞刮刮取，收集细胞裂解液并移至离心管，4℃离心13,000g，10min。（4）将上清移至新离心管中，可用于蛋白浓度测定或远期研究。2）准备磁珠（1）将proteinA和proteinG珠子分别摇晃5min混悬，各吸取50ul珠子到1.5mlEP管中，组成100ul珠子混合物。（2）小离心机离心20-30s，去上清。3）结合抗体（1）将肝细胞癌患者血清20ul和200ulAbBinding&WashingBuffer加入上述EP管中。（2）室温旋转10min孵育。（3）小离心机离心20-30s，去上清。（4）加入200ulAbBinding&WashingBuffer，轻柔吹打重悬珠子。4）免疫沉淀（1）将上述EP管离心，去上清。（2）取5ml蛋白裂解液轻柔吹打重悬珠子-抗体复合物。（3）室温旋转孵育30min（将抗原结合到珠子-抗体复合物上）。（4）离心机离心20-30s，将上清吸入干净离心管备用。（5）使用200ulWashingBuffer清洗珠子-抗体-抗原复合物3次，即轻柔重悬、离心去上清3次。（6）100ulWashingBuffer重悬珠子-抗体-抗原复合物，将混悬液移至干净EP管。5）洗脱目的抗原（1）将EP管离心，去上清。（2）加20uLElutionBuffer，轻柔吹悬复合物，避免产生气泡。（3）室温旋转孵育2min，分离复合物。（4）EP管离心，将上清放吸入新EP管备用。完成《WB实战指南》后，朋友曾央分享点免疫共沉淀方面的咚咚；当时不得不回绝。因为，WB指南是基于这些年的回复的汇总，基本上方方面面的问题都有提及，只需要做些串联；而论及coIP，目前在国内还不太普及，尽管它已经是生化领域最基本的技术之一。因此，再想写这么个长篇颇耗时间，于我的时间和精力太为难；不过，今天是个特殊的日子，凑凑热闹吧。——人，如果在某些方面成功了，必然在另外一面有亏欠，也许这就是上帝的公允吧。——在自己最擅长的地方找点成功的感觉吧，当然我的失败也只是因为没有更多的时间。。。哎！扯远了玩coIP也玩了5年多了，因为上手就是最难的B蛋白结合量多少的变化（假定IPA蛋白）而非检测B蛋白的有无，说句吹牛皮的话，在我们这个小领域三家最强的lab唯有我们敢于通篇基于这种检测手段，所以，对于coIP算是非常得有心得了。以下论述基于最难的B蛋白结合水平变化的检测，所以部分实验操作非常苛求；学会这个，其他就是小菜了；所以，这也算一个进阶篇。一.样品的制备。如《WB指南》，在这里我最强调从制备样品开始的一致性。如果不触及细胞的凋亡或死亡，那么任何处理组样品和ctrl最后的终体积应该保持一致；如果细胞有大量凋亡或死亡，可以通过比对标准体积对样品的体积粗略定量后再加裂解液，一般可以把误差控制在WB的检出范围以下，基本保持样品的均一；组织样品可以通过称重添加相应体积比的裂解液。裂解液的配方可以采用《WB指南》里给出的，原配方如下：20mMTris/HCl,pH7.6,100mMNaCl,20mMKCl,1.5mMMgCl2,0.5%NP-40andproteaseinhibitors（0.5MPMSF)此裂解缓冲液裂解条件相对温和，适合后续的coIP分析。“不过”用它做coIP有明显的缺陷；要理解此配方的缺陷，我们先聊聊如何在coIP实验中“作伪”。伪造结果，也分为单纯性造假和技术型伪造。撇去前者，从技巧上来讲，如果要想获得设定、预想的相互作用结果，可以从几个角度着手——此类结果可重复。a.在低盐离子裂解液中进行IP。很多蛋白复合体对盐浓度敏感，但敏感性有强弱之别。通常来说，真实存在着的蛋白复合体能耐受生理盐（0.15M）或更高浓度，即在生理盐浓度下不会解体。具体如，某种CDK和Cyclin其牢固程度能耐受0.8-1.0M以上的高盐而不解体，即使其抑制蛋白CKI能耐受0.6M以上高盐。因此，了解一个蛋白复合体对盐浓度的耐受，既是一个帮助判断蛋白复合体是否真实存在的一个重要依据，更是一个非常重要的生化数据；对某些体外生化反应的蛋白原料的纯化制备也是很重要的辅助依据。例如，纯化有生物活性的CDK和Cyclin，如果采用盐浓度漂洗，则最低需0.6M以上以解离CKI。所以，在生化领域的coIP分析中，很多实验体系的盐浓度是比生理盐浓度更高的。当然，不排除某些弱相互作用需要生理盐浓度，但这种情况不多见；也容易跟瞬时的相互作用混淆，某些实验中的弱相互作用实际是由于生化反应的瞬时性，且缺乏有效的截留、富集手段，诸如酶和底物。很多非生化领域的，喜欢在生理盐或更低盐浓度下进行coIP，这大大增加了假阳性的几率——很多蛋白间非特异性的黏粘被记录下来。这也成为了获得“设定的”相互作用的有效手段。b.过表达。现在已经存世的相当多的实验论文和数据，其蛋白复合体相互作用的数据是通过过表达，甚至原核GSTpulldown获得的；笔者认为，在阅读这类文献时，大家要特别小心，多长一个心眼——即始终抱怀疑的态度。并非说一定不可取，但是有一点很明确，这样的数据送到我们手里，首先我们会要求对方补充内源性蛋白相互作用的证据，否则该结果一律不采信。在《WB指南》里面我提过，血清中丰富的BSA可以被任意抗体识别（其实也是一种相互作用），那么同理高丰度的两种或多种蛋白人为拼凑到一起，为什么不可以非特异性的黏粘或者发生弱的相互作用呢？因此，如果想要“特定”的相互作用，可以考虑过表达所有的蛋白，就是核蛋白结合胞浆蛋白甚至膜表面受体也不稀奇。c.不添加NP40一类表面活性剂，削弱对非特异性结合的拮抗。NP40除可以在膜上穿孔外，也可以有效的拮抗非特异性的蛋白相互作用，提高coIP的特异性。因此，减少或不添加NP40也可以辅助“预期”目的。实际上，掌握a、b两点技巧，基本上可以“无往而不胜”——彻底搞定一切“想要的”相互作用。基于以上的原因，如果想获得切实可靠的相互作用数据，那么裂解液的选取相当讲究。1.首先盐浓度至少0.15M或以上。盐浓度主要指Na盐浓度。有人会问为什么不是钾盐？因为钾盐会更容易跟某些试剂（或离子）形成沉淀，诸如SDS，因此在某些情况下，钾盐会对后续的某些实验带来未知的麻烦，所以一般盐浓度指Na盐。盐浓度过低对某些与染色体结合较牢的蛋白的抽提（非破膜的温和裂解）效率也较差，可能会丢失部分信息；而盐浓度过高又会造成某些相互作用较弱的复合体解体，因此，通常选择0.15——0.3M做细胞裂解。纯化蛋白通常选取0.6M以上进行IP。小技巧：最初几遍的漂洗buff要和IP时的盐浓度相同。经验上，纯化蛋白时，若用低盐裂解细胞、高盐漂洗去杂质，蛋白丢失较多；所以，一般如前所述。当然，也可以高盐裂解低盐漂洗，但是对除杂质不利。2.通常IP体系中NP40含量0.2——0.5%。NP40在0.5——1.0%时，染色体很容易析出（很黏，成胶状会裹住beads，同时粘下很多蛋白），用这样的裂解液破碎细胞则可能需要超声。通常由于习惯上避免增加不必要的操作，所以在非必要的情况下，选择前述的浓度区间。3.可适当添加EDTA，螯合金属离子保护DNA和蛋白。特殊情况下还可选择添加EGTA，螯合Ca2+研究钙相关蛋白。此外，裂解液中甘油浓度一般介于15%-20%之间。4.很多市售或自制的裂解液过于温和，需要考虑采用机械或者超声等手段提高裂解效率（超声要慎用，可能破坏弱的相互作用）。但是，有些时候裂解液的冻融又可能影响某些弱的相互作用，所以不太建议冻融裂解液——即最好裂解液制备好后立即进行coIP。当然，如果证实冻融无影响可考虑将蛋白样品保存-80度待用，这对实验日程的安排会更平易。5.裂解产物的蛋白浓度越高越好。前几日回复一贴子，不知道出于什么动因该LZ主动稀释裂解样品的蛋白浓度再IP，所幸不是做coIP。上面提到过表达会制造相互作用的假象，反过来说蛋白浓度过稀，某些相互作用就测不到（不一定是弱的相互作用）。因此，细胞的裂解效率会直接影响实验的结果。通常细胞裂解产物的蛋白浓度可达7-8mg/ml左右，但是更常规的现象是达不到这种浓度；当然不是说低于7-8mg/ml就不能进行coIP，只是需要考虑这一因素。因此，在多数情况下要尽可能避免稀释你的细胞裂解液。【补充1】：切记！实验要先有结果再来挑战极限！在不少人的提问给出的流程中，其开始的样品量往往是以6well或者60mmdish为单位的；不否认某些蛋白或复合体确实可以在如此苛刻的条件下完成coIP。但是，更多的时候不是这样子的。以我自己研究的复合体为例，其内源性IP最低起始细胞数是40-50%confluence的145mmdish；比这个数目更低，实验结果就很不稳定甚至无信号。当某些药品、试剂非常昂贵时，鄙人才会勉为其难。否则，一律2dishes100%confluence，可以elute成30ul跑两次；相互作用微弱时，15ul仅跑一次；再弱，多养几块板（CE增加抗体和beads仍可保持不变，因此只浪费培养基总比浪费一个冗长的时间走麦城要好）。后续若为质谱分析，需考虑小规模量产。二、IP前的准备工作：coIP:分为内源性蛋白的相互作用和非内源性蛋白相互作用（后者包括外源蛋白之间以及外源拖内源蛋白）。非内源性蛋白的相互作用，主要是通过过表达来实现，通常为简化实验、提高IP效率会让外源蛋白带上标签（tagged；这也是没有相应的可用于IP的内源蛋白抗体之前唯一可行的方案），因此就tag的使用而言存在很多小技巧。a.His-tagged主要用于纯化蛋白。有些人喜欢用His-tagged蛋白然后进行coIP，实际上它存在潜在的隐患。当初鄙人用Sigmaa-His（鼠单抗；免费广告）WB外源蛋白发现CE里面一塌糊涂（带型漂亮就是非常多的带），那时候还抱怨这个抗体特异性不好。后来，当了解到很多蛋白会有富含histidine的domain以后，恍然大悟，恰恰是因为效价非常好，所以很多内源性的蛋白都被该抗体识别。同理，如果用Ni-NTAbeads去PDHis-tagged的蛋白，完全有可能PD那些内源性的富含histidinedomain的蛋白，造成coIP的假象，而这样的蛋白还非常多。那么，当初开发Histag的主要目的，个人认为主要是可以用廉价的化学试剂洗脱，且Ni-NTAbeads这类非抗体类的beads成本低廉，可大量工业生产。因此，用这个tag去生产有活性的蛋白是首选。b.tandem-tagged不能用于分析钙调信号通路。tandemtag实际上从成本角度和Histag差不多，洗脱试剂价格低廉，因此可用于大规模PD之后的质谱分析，能获取最全面的相互作用的信息。然后由于其中包含钙调蛋白相互作用domain，天然会结合钙信号相关蛋白，从而干扰或掩盖靶蛋白与钙信号蛋白之间的相互作用，有一定的应用局限。当然，笔者不太清楚近年来该方法有无改进，但正是由于引入钙调domain才实现了降低成本的目的，因此猜测可能性不大。c.Myc、HA、Flag-tagged：Myc仍然会有天然的干扰，应用略有局限；相较后两者是人工合成专门用于tagged蛋白（有相应的专利，因此目前无论抗体或交联好的beads价格都非常昂贵），因此干扰最小、最常用。如需进一步细致区分，a-Flag效价比a-HA略高，因此更适合IP。当然，公司仍在努力寻找效价更好的a-HA以及IPHA的抗