免疫分析法在农药残留分析中的应用

免疫分析法在农药残留分析中的应用应化1007班刘洋2010016197【摘要】基于抗原与抗体特异性反应的免疫分析技术(IA)具有灵敏度高、快速、方便筒捷的特点，尤其适宜现场筛选和大量样品的快速分析。本文简要介绍了农药残留免疫分析方法及免疫分析技术在杀虫剂、杀菌剂、除草剂和生长调节剂等农药残留快速监测中的应用进展。【关键词】农药残留免疫分析1.引言农药的大量使用所造成的环境污染问题，已引起人们的高度重视。随着环保意识的加强和经济的发展，我国对环境、食品中农药残留的监测，也日益重视。加强对农药残留监测研究，对于合理使用农药、保护环境和保障人类健康，具有重要的理论和现实意义。随着待检样品逐步增多和对农药残留检测灵敏度、效率要求的提高，对高灵敏度、快速检测分析新技术的开发需求也日益迫切。传统的农药残留分析方法有液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、质谱(MS)等多种理化分析手段，存在样品前处理复杂，仪器设备昂贵，且要求熟练的技术人员，完成一次分析费时长等问题。特别是这些方法不能满足样品现场快速检测的要求，迫使人们运用新的原理和方法去开发特异性强、灵敏度高、方便快捷、安全廉价的分析新技术。免疫化学分析技术灵敏、简便快速，正可以满足这些需求，受到农药残留检测工作者的重视，正逐渐成为农药残留快速检测的一个热点，并显示出独特的优势。2.免疫分析法的概念免疫分析法(InununoassayIA)是一种抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物质进行定性和定量分析的分析技术。20世纪90年代以来它在检测粮食、水果蔬菜、肉、奶、水和土壤中农药的残留分析上得到迅速发展，成为扰先研究、开发和应用的一项分析技术。免疫分析法具有特异性强、灵敏度高(检测极限可达l～l000ng/ml)、方便快捷、分析容量大、检测成本低、安全可靠等优点。一般不需要贵重仪器，可大大简化甚至省去前处理过程，对使用人员的专门技术要求不高，容易普及和推广。该技术开发的产品—检测试剂盒，可广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。因此，人们称免疫分析技术是21世纪最具竞争性和挑战性的检测分析技术。3.农药残留免疫分析技术及方法3.1免疫分析标记抗体的类型农药残留的免疫分析方法是在已有免疫学实验的基础上建立起来的，因此它的免疫学反应原理及操作过程都与其他免疫检测方法相类似。用于农药残留免疫分析上的抗体标记方法主要有4种类型，即放射性标记、酶标记、生物素标记和荧光抗体标记。早期的农药残留免疫分析标记抗体主要是以碘标记为主，但由于这种标记方法半衰期短，而且对环境和人有潜在的危险性，因而逐步被酶标记所替代，由此建立的方法称为酶免疫分析法(EIA)：酶标记的抗体保存期长，具高敏感性，显示结果直观并可进行光谱分析，这为农药残留定性、定量分析带来很大的方便。标记在抗体上的酶主要是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和S—半乳糖苷酶在检测过程中，当加人适当的底物时产生特殊的颜色反应，用于检测此外，生物素标记和荧光抗体标记检测农药残留的应用也有不少报道。3.2农药残留免疫分析检测方法用于农药残留免疫分析反应的类型绝大多数是抗体或抗原竞争型反应，其检测方法有两种：一种是抗原捕获法，将已知量的标记抗原与含有未知量的待测抗原混合在一起，然后将该混合液与吸附在固相上的亚饱和量抗体孵育，检测液中含量高的抗原将减少标记抗原的结合，这样通过已知标准曲线定量出不同目标检测物的浓度；另一种是“三明治”分析法，是先把抗原吸附在固相上，然后将混有待测抗原的一抗抗体混合液与吸附在固相上的抗原孵育，冲洗掉已结合的抗体，再加人酶标记的二抗抗体与其共同孵育，最后测定标记抗体上酶催化底物产生的光吸收值的大小来确定农药残留的量，也可将一抗抗体直接用酶标记，然后测定结台抗体上的酶所催化底物产生的颜色反应。酶标记反应的固相支持物有聚苯乙烯、塑料管、膜和微球。目前大多数采用96孔酶标板(MTP)作为固相支持物，这种板的检测容量大，样本数量多，其检测反应结果只需有酶标仪的配台就可得出准确的检测数据，与其他检测手段相比，此种方法更易被使用者接受。3.3利用生物传感器进行免疫分析生物传感器通常是指由一种生物敏感部件与转换器紧密结台，对特定种类化合物或生物活性物质具有选择和可逆响应的分析装置。免疫反应传感器是利用目标化合物与抗体的特异性接合，产生一系列的物化反应，利用转移器使其将完成特定形式的反应信号，再通过监视器把这些特殊信号变成可视数据用于检测。最早研制成功的是对硫磷的生物传感器，以后又有人制成了光导纤维免疫传感器，利用荧光标记抗体产生的反应，对对硫磷在溶液中含量进行了分析测定。微型化的免疫传感器对分析样品的用量少、响应速度快，可进行快速跟踪分析。目前生物传感器主要存在问题是分析结果的稳定性、可重复性及使用寿命和使用成本。4.免疫分析法在农药残留分析中的应用20世纪80年代初Hammock等首次将免疫技术用于农药残留分析以来，已有60余种农药建立了免疫分析方法，几乎包括了杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物生长调节剂等所有农药类别，检测样本以农产品、食品、饲料和环境为主，测定方法几乎都以酶免疫分析、尤其酶联免疫吸附测定为主(表1)。90年代以来已有众多农药免疫分析商业试剂盒问世，其最小检出浓度达2μg/kg(有机磷类)和300ug/kg(氨基甲酸酯类)。近年来，更加经济、快速高效的多种有机磷同时分析免疫传感器分析也取得进展。5存在问题与应用前景农药残留的免疫分析技术经过多年的发展，已经取得了可喜进展，但由于农药品种繁多、结构复杂、检测样本各异等原因，该技术的研究和开发应用仍存在很多尚待解决的问题。(1)人工免疫抗原的合成能否制备稳定并有良好免疫原性的抗原是方法建立的前提和关键，农药结构类型复杂，对每一种农药半抗原合成要经过仔细设计，既要保留农药分子的基本结构特征，又要使其能够很好的与载体蛋白结合，往往要设计多个目标分子进行优化选择，不仅工作量大、周期长、成本高，而且许多设计的目标分子还难于合成。虽然在半抗原和免疫抗原合成设计方面积累了一些经验，但有关半抗原结构、免疫抗原结构与结合比及其与免疫活性的关系尚未深入研究，致使难于筛选到活性高的免疫抗原。(2)免疫反应的特异性和抗体的选择性免疫分析方法要求其抗农药抗体对于结构非相关农药表现高特异性和高选择性，但是一类农药往往是通过修饰一类母体结构上特定基团来衍生出多种生物活性的品种，在免疫分析过程中这些与待测农药结构类似的农药或待测农药代谢物可能发生不同程度的交叉反应，导致定量检测准确度降低或者甚至出现定性假阳性与假阴性，可靠性和检测灵敏度也降低。解决的办法是制备特异性高的抗体，尤其是生产周期短、操作简便、稳定的单克隆抗体。但从另一角度看，可以利用这类交叉反应检测结构类似农药残留的总量，在现场初筛十分有效。(3)方法的标准化影响农药残留免疫分析结果的因素多且不易控制，难以标准化。一是样本类型复杂，基质效应可能抑制免疫结合反应，不同品种农药性质各异，样本处理方法存在许多不确定性；二是抗体特异性和稳定性对检测结果影响机制尚不明确，易受诸多因素影响。因此，免疫分析方法常常需要与理化分析结果进行相关性试验评价。总之，目前农药残留免疫检测还是主要基于酶免疫分析法，且尚存在一定局限性，也不可能替代传统的色谱分析技术。但免疫分析技术自身优势和在方法上的不断完善，尤其是亲合力强、特异性高的标准化抗体生产技术的突破和免疫传感器技术的日臻完善，必将在农药残留快速监测领域发挥愈来愈重要的作用。参考文献【1】杨依军,王勇等.免疫分析法在农药残留分析中的应用[J].华北农学报,2001,16(4):119~124【2】王升吉,杨崇良等.免疫分析法在农药残留检测中的应用及前景[J].山东农业科学,2005,(4):72~75【3】黎其万,潘灿平.农药残留免疫分析方法及其应用研究进展[J].西南农业学报,2004,17(2):248~252