免疫印记手册第六版

1《蛋白质印迹手册》第六版Westernblotting技术作为生物实验室中最给力的工具之一，一直被研究人员广泛使用。默克密理博公司的《蛋白质印迹手册》（ProteinBlottingHandbook）详细介绍了westernblotting的原理、操作和技巧，无论是对初学者，还是对希望进一步优化实验的达人，都将带来极大的帮助。最新第六版的手册在优化抗体浓度和降低背景方面增加了更全面的指引，同时扩展了荧光检测的数据和操作步骤，是蛋白质印迹实验不可缺少的好伙伴。一、膜的选择：(p2)二、蛋白质结合：(p5)三、印迹方法：原理与优化(p2)1.印迹原理与优化2.WB之蛋白分离3.WB之蛋白转移4.转印缓冲液5.影响转印的因素6.开发一种新的转印操作7.蛋白质观察四、蛋白质鉴定：1.免疫检测2.影响免疫检测的因素3.质谱分析五、实验操作：1.蛋白质转印操作（1）湿转操作详解（2）半干转操作详解（3）狭缝印迹操作详解2.蛋白质观察操作3.免疫检测操作（1）标准的免疫检测方法（2）快速的免疫检测方法4.膜剥离再生操作5.蛋白质消化&印迹保存操作六、故障排查：1.故障排查2.印迹失败的例子和原因2一、膜的选择摘要：PVDF膜和NC膜作为Western印迹应用中最常用的两种类型的膜，各有什么特点？我们该如何选择？近四十年来，默克密理博一直是转印膜的领先供应商。它目前提供三种PVDF膜。这三种膜有何不同，分别适合哪些应用呢？详见本文。印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素：•蛋白质结合能力•是否需要用醇预湿•开展多次剥离（stripping）和再生检测（reprobing）实验的能力•蛋白质观察•长期印迹保存•信噪比聚偏二氟乙烯（PVDF）和硝酸纤维素(NC)是Western印迹应用中最常用的两种类型的膜。硝酸纤维素膜和PVDF膜的特性比较详见表1。表1.PVDF和硝酸纤维素膜特性及应用的比较3与硝酸纤维素膜相比，电转到PVDF膜上有许多优点。PVDF膜可提供更好的蛋白质截留率、物理强度和广泛的化学兼容性（Pluskal等，1986）。其中更高的机械强度和出色的耐化学性让PVDF膜成为免疫检测中各种染色应用和二次检测的理想选择。使用PVDF膜的另一个优点是，单块凝胶上的平行重复泳道可用于各种应用中，如考马斯蓝染色，接着切割条带进行N端测序，蛋白质水解/肽段分离/内部测序，以及免疫检测（Kurien等，2003）。市售的硝酸纤维素膜的典型结合能力是80–100μg/cm2，而PVDF膜的结合能力是100–200μg/cm2。在检测血清中人免疫缺陷病毒（HIV）时直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，结果表明，PVDF膜有着更好的总体HIV抗原截留率，并且有助于改善提高抗体对糖基化包膜抗原的检测（Lauritzen和Pluskal，1998）。Immobilon®PVDF转印膜默克密理博提供三种PVDF膜：•Immobilon®-P膜（0.45μm）是一种通用的基质，适用于一般的免疫印迹应用。•Immobilon®-PSQ膜（0.2μm）适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45μm膜更高的截留率。•Immobilon®-FL膜（0.45μm）是为荧光免疫检测而开发的。它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。Immobilon®转印膜以卷膜和方片膜形式提供。预切好的膜与所有预制胶以及大部分市售的凝胶电泳系统兼容。Immobilon®转印膜的性质详见表2。表3列出了与最常用的电泳系统相匹配的Immobilon®预切膜的尺寸。表4列出了与现有的预制胶相匹配的Immobilon®预切膜的尺寸。表2.Immobilon®PVDF转印膜的性质和应用4表3.Immobilon®PVDF预切转印膜和匹配的电泳系统表4.Immobilon®PVDF预切转印膜和匹配的预制胶5二、蛋白质结合摘要：一旦膜被浸湿，蛋白质结合可通过蛋白质与膜的接触而实现。由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度（深度），结合能力是由孔的内部表面积来决定的。Immobilon®-P与Immobilon®-PSQ转印膜在蛋白结合能力上有何差异？影响蛋白质结合的因素有哪些？PVDF本质是一种疏水性的聚合物，在水溶液中不会浸湿。为了在水性缓冲液和系统中使用PVDF膜，首先必须将其浸泡在50%（v/v）或更高浓度的醇溶液中。甲醇、乙醇和异丙醇都适合浸泡这种膜。随着膜的外观从不透明到半透明，完全浸湿是显而易见的。之后必须用水反复冲洗，以去除醇类，再将膜直接放入转印缓冲液中平衡。Immobilon®-Pvs.Immobilon®-PSQ转印膜一旦膜被浸湿，蛋白质结合可通过蛋白质与膜的接触而实现。由于蛋白与膜结合的发生贯穿整个膜的厚度（深度），结合能力是由孔的内部表面积来决定的（Mansfield，1994）。Immobilon®-PSQ转印膜的内部表面积大约是Immobilon®-P转印膜的三倍，使其吸附能力更高（表2）。表2中所列的数值代表了膜表面在非变性缓冲液中饱和后蛋白质结合的上限。在任一指定的应用中，都可以预期Immobilon®-PSQ转印膜能比Immobilon®-P转印膜结合更多的蛋白质。然而，分析中可实现的最大结合能力往往取决于所采用的具体操作步骤，这是由于蛋白质构象的差异，所使用缓冲液的化学性质，以及样品上样所用方法的限制。Immobilon®-P与Immobilon®-PSQ转印膜之间结合差异的例子如图1所示，其中蛋白质样品从聚丙烯酰胺凝胶上电转过来。部分蛋白质穿过Immobilon®-P转印膜，被第一张膜后面的第二张膜所捕获。相比之下，所有蛋白质与Immobilon®-PSQ转印膜结合，而未穿过。在这种情况下，紧密的孔结构和聚合物较高的内部表面积有助于所有转移蛋白的完全吸附。不过，Immobilon®-PSQ转印膜上的免疫检测可能产生较高的背景，需要更严格的清洗条件。因此，膜的选择是由实验目标决定的：对于20kDa蛋白质的高灵敏度检测，使用Immobilon®-P转印膜，但如果分析较小的蛋白质，或必须捕获100%的蛋白质进行肽段测序，则要转换成Immobilon®-PSQ转印膜。图1.利用Immobilon®-P和Immobilon®-PSQ转印膜进行蛋白质的延长电转。分子量标准品（第1、3、5、7泳道）和小牛肝裂解液（第2、4、6、8泳道）通过槽转印法转移到Immobilon®-P或Immobilon®-PSQ膜，并用考马斯亮蓝染色。在第一张Immobilon®-PSQ转印膜的后面再放一张，以捕获穿过的蛋白质。（第5和6泳道在Immobilon®-P后面；第7和8泳道在Immobilon®-PSQ后面。）6影响蛋白质结合的因素在分子水平，蛋白质吸附至少部分源于疏水氨基酸侧链与聚合物表面疏水区的相互作用。Matsudaira（1987）观察到，在疏水残基被切割之后，小肽的测序效率下降80%，这可能是由于残余肽段被洗脱。同时，在肽段消化降解时，人们也观察到疏水肽段往往不能像亲水肽段那样高效洗脱（如Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991）表明，转印缓冲液中添加的Ca2+离子可增强钙调蛋白与Immobilon®-P转印膜的结合。钙的结合导致蛋白质分子结构中形成一个疏水袋。三、印迹方法：原理与优化1、印记原理与优化过滤（抽滤）过滤是将蛋白质上样到膜上的直接方法。一个溶解的样品可以通过抽真空而滤过膜。蛋白质吸附到膜上，而样品的其他组分则穿过膜（图2）。或者，将样品直接点在表面上，并让其干燥。固定在膜上的蛋白质随后可用于分析。斑点印迹（图3）和狭缝印迹是过滤方法的两个版本，它们采用多管吸印仪（manifold），将样品以斑点状或狭缝状上样到膜上。这些技术被作为快速筛选大量样品的定性方法，或分析相似样品的定量技术。它在测试实验设计参数是否适用于更复杂分析时特别有用。过滤方法的另一个版本是网格免疫印迹，当样品量非常有限，无法用ELISA等传统技术来开展分析时，这种技术很有用，适合高度并行的样品分析。例如，网格免疫印迹已用于过敏原特异的抗体应答鉴定，只需要极少量的患者血清（Reese等，2001）。在制备过滤法印迹时，请注意以下方面：•去污剂会抑制蛋白质吸附到膜上。样品溶解和清洗所用的缓冲液中的去污剂应不超过0.05%，且只在需要时添加。•样品量应足够大，以覆盖每孔中暴露的膜，但又不能超过膜的结合能力。•颗粒负载高的样品可能会堵塞膜，而那些高粘度的样品会降低流速。颗粒应通过预过滤或离心来去除，并只将上清上样到膜上。粘稠的样品应用缓冲液稀释。图2.利用过滤的印迹系统。7图3.利用Immobilon®Western化学发光HRP底物在人血清的斑点印迹上检测转铁蛋白（详见操作步骤1.4斑点印迹，第40页）。利用山羊抗转铁蛋白抗体（稀释度1:10,0000）和兔抗山羊HRP结合的二抗（稀释度1:50,000），在Immobilon®-P膜上检测连续稀释血清中的转铁蛋白，重复两次。2.WB之蛋白分离Western印迹包含下列步骤：•在聚丙烯酰胺凝胶上分辨一个复杂的蛋白质样品。•将分辨好的蛋白质转移到膜上。•膜上特定蛋白质的鉴定。对于一个成功的Western印迹，必须满足四个要求：•从凝胶上洗脱–在转移过程中蛋白质必须从凝胶上洗脱。如果它仍保留在凝胶上，则无法开展印迹分析。•吸附到膜上–在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上。如果蛋白质不吸附，则无法开展印迹分析。•处理过程中的蛋白截留–在转移后的印迹处理过程中，蛋白质必须仍然吸附在膜上。•处理过程中蛋白的可及性–吸附的蛋白质必须能与检测它的化学试剂接触。如果蛋白质被掩蔽，那它就无法被检测。下面将讨论Western印迹中所涉及操作的理论和实际考虑。在1-D或2-D凝胶上分离复杂的蛋白质混合物在印迹之前分离复杂蛋白质混合物的最常用方法是一维（1-D）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），其中蛋白质是根据其分子量分离的（图4）。在某些情况下，使用非变性条件来分离天然蛋白。尽管这种方法通常不及变性电泳的分辨率，但是在一抗只识别非变性蛋白或必须在膜上保留蛋白质的生物活性时，这特别有用。8二维（2-D）凝胶电泳是分析细胞类型、组织和体液中蛋白质组成的理想技术，也是蛋白质组学的核心技术。2-D凝胶的免疫印迹提供了分子量和等电点的信息，在区分翻译后修饰所产生的蛋白质异构体上很有用（Celis和Gromov，2000）。在某些情况下，通过等电聚焦的一维分离后的免疫印迹可实现蛋白质分型（Poland等，2002；Eto等，1990）。二维印迹的例子如图5所示。分子量标准品凝胶中包含分子量（MW）标准品，或marker，有助于在电泳分离后估计感兴趣的蛋白质的大小。目前有两种类型的标准品，未染和预染。未染的MWmarker通常包含已纯化的分子量已知的天然或重组蛋白。观察它们在凝胶或膜上的定位需要借助一个染色步骤。预染的MWmarker如图4所示。使用预染marker既有优点，也有缺点。预染marker可实现在电泳过程中监控凝胶上的蛋白质分离。它们也能指示后续转印步骤中的转移效率。然而，它们相对较贵，且染料的添加可能影响蛋白质迁移率。在确定分子量时，预染marker没那么准确，因为蛋白质上结合的染料会改变印迹过程中它们吸附到膜上的能力。图4.TrailMix™蛋白标准品（货号70982）上带有三个预染marker和八个未染marker（它们都带有HisTag和S•Tag），实现了电泳过程中蛋白质迁移的直接观察以及任一Western印迹上准确的大小判定。9图5.通过二维电泳分离的蛋白质的化学发光检测。大鼠成纤维细胞系的银染2-D凝胶（左）和同一张凝胶的印迹（右），在Immobilon®-P膜上用小鼠单克隆抗体杂交，并通过化学发光法观察。聚丙烯酰胺的浓度凝胶上聚丙烯酰胺的浓度可以是均匀的，也可以是梯度的。最常用的聚丙烯酰胺浓度，10%，最适合10-150kDa范围