克隆实验细则

准备：1、瓶子、量筒、钥勺、天平、摇床等；2、50ml离心管、1.5mL的离心管，125uL的PCR管、各种枪头、培养皿；3、超净工作台、酒精灯、蜡带封口膜、铝箔。LB培养基：（1L)胰化蛋白胨：10g，Tryptone酵母提取物：5g，yeastextractNaCl：10g放好药品（100mL的培养基，加入200uL的20mg/mL的X-Gal，50uL的50mg/mL的IPTG,50uL的100mg/mL的Amp以后，振荡均匀，高压蒸汽灭菌120℃(注意：高压灭菌，瓶盖要松，用胶带黏住两端），22min。在60℃时，转紧瓶盖，拿出置于实验台上。固体培养基：LB固体培养基1L,和液体一样，加15g琼脂粉，一定要在温度下降到55℃之前加好抗生素，并且倒板。LB固体培养基倒板：1、配制：1000mL培养基加入1.5g琼脂粉。2、抗生素的加入：高压灭菌锅后，待温度降到60℃，将培养基拿出置于超净工作台中，大概降到55℃（手可以触摸加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并且充分摇匀。3、倒板：一般10mL到1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外灯下照10—15min。4、保存：用封口胶封边，并倒置用铝箔包裹放于4℃保存，一个月内使用。一般克隆实验：超净工作台开启紫外提前半个小时1、DNA目的片段:T-vector：0.5uLDNA:4.5uL2、加入5uLSolutionI（离心）。（注意步骤1和2：在冰上操作，慢慢加入，因为不稳定）3、16℃反应1h左右，如果目的片段太长，可以延长时间。（零下20℃保存）。4、10uL上述体系中然后和50uL大肠杆菌感受态cell，冰上静置30min，不可剧烈振动。(同时开启水浴锅，将SOC液体培养基放置在37℃烘箱中待用）5、42℃水浴1min后，冰上静置1min。6、将55uL的上述混合液体加入到500uL的SOC液体培养基中，摇床摇菌，37℃，振荡培养基1h或者1h以上（180r）。溶液有清澈变成稍显浑浊。7、离心3000r，8min，丢弃上清，200uL-300uL混合液轻轻吹打，打入到铺有薄层固态培养基的培养皿中，涂板，固态培养基中已经加有X-Gal,IPTG,Amp。37℃过夜培养，4℃保存。8、挑菌，用枪头挑出白色的菌落，直接连枪头一起打入加有抗生素的液体培养基，培养基置于1mL的离心管中，摇床培养4h，37℃，220r，（抗性LB避光保存）。溶液有清澈变为稍显浑浊。此时可直接拿出去测序，亦可以直接取2uL用于PCR.分子克隆实验步骤：1、配制液体培养基（Amp+,无Amp），固体培养基。2、配制好的培养基要分装在1.5mL的离心管中，-20℃保存。Amp：溶解1g的Amp与水中，定容至10mL，得到到浓度为100mg/mL的溶液，分装在1.5mL的离心管中，-20℃保存。，用的时候稀释2000倍，配成50ug/mL的工作用浓度。储存液的浓度为50mg/mL.IPTG:将5g溶于1L灭菌水配制50mg/mL水溶液，过滤灭菌后，按1mL分装，-20℃避光保存。工作浓度为50mg/mL。X-Gal：工作浓度20mg/mL，储存浓度20mg/mL，-20℃避光保存。转化实验：准备：DNA,Vector试剂盒（冰上操作）16℃水浴，42℃水浴。无抗培养基（50mLXn）Amp+培养基（50mLXn）板，solutionI5uL操作：1、DNA：4.5uL+Vector：0.5uL+solutionI：5uL对照：Controlinsert：1uL+Vector:0.5uL+dH2O:3.5uL+solutionI：5uL2、16℃培养30min。3、加入100uLCell，冰上放置30min。4、42℃培养60s，冰上放置1min。5、加入1mLLB无抗，37℃摇菌1h，180r。6、8000r，离心8min，800uL丢弃，200uL吹打。7、涂板（抗）。8、挑菌，加入1mL抗性LB。IPTG:是一种β-半乳糖苷酶的的活性诱导物质，当载体DNA以lacZ缺失，由于的细胞为宿主进行转化时，如果在平板培养基中加入X-Gal和IPTG由于β-半乳糖苷酶法人α-互补性，可以根据师傅哦出现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体，此外还有lac等启动子的表达载体的表达诱导物使用。诱导的原理：E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与半乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。首先把IPTG配制成50mg/ml的水溶液，并进行过滤除菌后保存。然后在100ml的琼脂培养基中，加入50μl的上述溶液、200μl的X-Gal（20mg/ml的二甲基甲酰胺（DMF）溶液）和50μl的Amp（100mg/ml），制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体（或其他带有lacZ、Amp基因载体），然后转化至lacZ缺失细胞中后，涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基，可根据长出菌体的蓝白色，而方便地挑选出基因重组体（白色为具有DNA插入片段的基因重组体）。