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一.基本原理流式细胞仪的主要结构可以大致分为这样几个组成部分:激光系统,流式系统,信号处理及放大,计算机系统。当待测标本被制务成单细胞悬液,经染色后进入流动室,流动室内充满流动的鞘液,鞘液压力与样品流压力是不同的,当二者的压力差异达到一定程度时,鞘液裹挟着的样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区.如果我们将细胞中感兴趣的部分特异性地标上荧光染料,那么这些染料将在细胞通过激光检测区时受激发出特定波长的荧光,通过一些波长选择通过性的滤色片,我们可以将不同波长的散射光,荧光信号区分开来,并送到不同的光电配增管中,经过一系列信号转换,放大,数字化处理,我们就可以在计算机上直观地统计染上各种荧光染料的细胞各自的百分率.选择不同的单克隆抗体及荧光染料,我们可以利用流式细胞仪同时测定一个细胞上的多个不同的特征,如果对具有某种特征的细胞有兴趣,我们还可以利用流式的分选功能将其分选出来,以便于进一步培养,研究。二.流式细胞仪在免疫学中的应用1.淋巴细胞亚群分析淋巴细胞是正常机体免疫系统功能最重要的一大细胞群,在免疫应答过程中,未梢血淋巴细胞发育成为功能不同的亚群.各亚群的数量和功能了生异常时,就能导致机体免疫紊乱并产生病理变化.FCM可以同时检测一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原,将不同的淋巴细胞亚群数量的测定来监控病人的免疫状态,指导治疗.2.感染及其治疗效果观察由于T淋巴细胞在人体免疫系统中承担着重要的功能,因此,当感染发生时,T淋巴细胞各亚群的变化往往能很敏感地反映感染的状态与程度.例如,细胞膜外CD4分子有HIV识别部位,因此CD4细胞是HIV病毒受体,AIDS病人CD4+T细胞明显减少,该指标是诊断AIDS的重要标志.当病毒感染发生时(如乙型肝炎,EB病毒和巨细胞包涵体病毒),CD8+T细胞增多,对CD8细胞的测定有助于对感染的诊断,治疗效果的动态观察.利用流式细胞仪可判断受者的免疫状态、免疫抑制剂疗效和全身免疫抑制程度。移植前交叉配型检测类抗原的抗体(PRA)、血管内皮细胞抗原(VEA)抗体，可以提高移植成功率。在器官或骨髓移植后病人进行监控.当病人CD3+,CD25+持续增加提示已经开始发生排异,CD4/CD8持续下降表明有感染发生,当其比值小于0.2时必须停用免疫抑制剂.由于流式细胞仪将静态的,显微镜下肉眼观察改为动态的,计算机信号处理,因此,在流式细胞仪上T细胞亚群统计方式已从传统的荧光显微镜下计数200个细胞成为几秒钟内计数上万个,因此结果更真实,更具有统计意义.3.疾病的诊断3.1DNA含量分析以及细胞分化周期分析DNA含量分析的目的在于确定某一组织或细胞群体的增殖状态，引入DNA指数(D1)即DNA倍体的概念可以用于区别肿瘤的良恶性，恶性肿瘤的增殖状态。二倍体细胞的DI=1，在临床上二倍体细胞DI在0.9—1.0之间，根据DI可以确定细胞DNA倍体。3.2细胞凋亡(cellapoptosis)检测细胞凋亡可清除体内有害的细胞群，维持内环境的稳定。细胞凋亡阐明一些疾病的发病机制，导致疾病新疗法的出现。FCM利用光散射和荧光染色能够通过检测细胞光散射改变、膜结构和转运功能改变、DNA含量变化和DNA断裂点标记，从多方面分析和鉴定凋亡。是目前能够同时区分凋亡与坏死的唯一手段。3.3Th1与Th2细胞及细胞因子辅助性T细胞根据其产生的细胞因子及功能的不同可分为Th1与Th2两大类。Th1细胞分泌IL-2、IFNγ、主要参与细胞免疫；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6及IL-10，主要参与体液免疫。两者相互调节、相互平衡，其平衡失调与多种疾病有关。应用流式细胞仪可检测细胞内细胞因子。3.4网织红细胞计数，使用噻唑橙(ThiazoleOrange,TO)染料,可与核酸形成荧光-核酸复合物,流式细胞仪上检测50000个红细胞求得百分率与绝对数,有助于贫血的鉴别3.5糖皮质激素受体（glycocorticoidreceptor,GCR）检测测GCR常用细胞溶质放射配基受体（请确认）结合测定，它可定量，但需细胞量多、检测时间长。流式细胞仪可测淋巴细胞总GCR，此法虽半定量，但检测所需样品量少。对长期激素治疗或确定下丘脑-垂体-肾上腺皮质（HPA）轴功能紊乱，评估细胞内GCR水平有一定价值。3.6环氧合酶（Cyclooxygenase,COX）检测环氧合酶（COX）是花生四烯酸合成前列腺素（PG）的限速酶。它催化产生的PG参与机体多种生理和病理生理过程。COX有两种类型:COX-1和COX-2。COX-1为结构性的“看家基因”产物,在多数组织细胞中持续低浓度表达，参与维持机体正常的生理功能。COX-2为可诱导性的，炎症、细胞因子、生长因子等刺激可使其大量表达，参与和加重炎症反应，促进肿瘤细胞增殖、新生血管形成，促进黏附、抑制免疫与抑制细胞凋亡。应用流式细胞仪可监测人血单核细胞经LPS刺激后COX-2与COX-1的水平。对炎症、血栓、肿瘤等病的发病机制、疗效和预后判断均有一定价值。4．可化疗药物用药指导，敏感药物筛选药物作用处理后的细胞采用Calcein-AM与PI染色。Calcein-AM为非荧光乙酰甲氨基酯经活细胞非特异性酯酶水解可变为荧光结合物，而死细胞不能水解因而无荧光。死细胞可被PI染成红色，活细胞不被PI染色，两者区分明显，可用以筛选药物。