免疫组化ABC法

免疫组化染色步骤(ABC法)第一天：【准备：试剂、37℃恒温水箱打开】1．切片脱蜡：第一排试剂瓶从左至右（二甲苯→Alcohol），二甲苯内浸泡10min，Alcohol内浸泡5min。【二甲苯→二甲苯→100%Alcohol→100%Alcohol→95%Alcohol→90%Alcohol→80%Alcohol→70%Alcohol】2．TBS洗10min×3，置摇床上。3．【注意避光】用0.3%H2O2和0.3%Triton混合液处理切片30min，置于摇床上。增加切片渗透性。【注：H2O2原液是30%，先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2】4．TBS洗10min×3，置摇床上。5．抗原修复：塑料染缸中加入250mL0.05MCitratebuffer（或0.05MTris-HCl缓冲液）液，然后放入片子，调至“解冻”档，先微波加热5min（温度升至95oC左右），继续加热10min,中间冷却5min，再加热10min，然后室温冷却20min6．TBS洗10min×3，置摇床上。【如果掉片严重，5、6和3、4调换一下】7．将切片取出，组织周围的水分用滤纸吸干，用特制的记号笔（冰箱中，可防止液体流出）在组织周围划上圈后放入湿盒中，并在圈内滴入5%羊血清，做到完全覆盖住组织，然后将湿盒放入恒温水箱（37℃）中20-30min。8．将湿盒取出，把切片上的羊血清轻轻倒掉，用滤纸擦干留下的水道，否则再加入的液体将会沿着水道流出。加入Ι抗，做到完全覆盖住组织，放入湿盒中，置恒温水箱（37℃）1h。9．从水箱中取出湿盒，放入4℃冰箱中过夜。第二天：【准备：37℃恒温水箱打开】10.取出湿盒（室温30min，恢复到室温），将抗体倒掉，TBS洗10min×3，置摇床上。11.滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入相应Π抗，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h12.取出湿盒，将Π抗倒掉，TBS洗10min×3，置摇床上。13.用滤纸将圆圈周围的水分吸去，加入ABC【AB（1:1），A：TBS=1:200，B：TBST=1:200，提前30分钟配制，室温放置】，做到完全覆盖住组织，放入恒温水箱（37℃）中1h。14.TBS洗10min×3，置摇床上。15.【避光】加入DAB，快速滴入，在显微镜下观察染色情况，一般5min，如果显色依然很浅，可以延长至10min，视情况而定。16.先用TBS洗10min，2次，置摇床上。17.脱水，透明：第一排试剂瓶从左至右（alcohol→二甲苯）【3min70%Alcohol→3min80%Alcohol→3min90%Alcohol→3min95%Alcohol→3min100%Alcohol→3min100%Alcohol→5min二甲苯→5min二甲苯】18.封片缓冲液TBS或PBS均可，但要统一溶液配制：1、10×TrisBufferedSaline(TBS)、10×TBST配方：24.2gTrisbase，80gNaCl，adjustpHto7.6withHCl(useat1×).10×TBST（3%Triton）：30ulTriton-100+970ulTBS（37℃）2、0.3%H2O2+0.3%Triton+TBS：【注意避光，提前20min配，37oC水箱溶解Triton】99mlTBS（1×）300lTriton【先把Triton溶解在TBS中后，再加入H2O2。】3、0.05MCitrateBuffer柠檬酸盐缓冲剂：【需调pH，提前配】Citricacidmonhydrate柠檬酸21.01gSolution1：ddH2O1000mlSodiumcitrate水合柠檬酸三钠29.41gSolution2：浸入40℃温水中（将一小烧杯置于盛有温水的较大烧杯中），充分搅拌，加入30%H2O21mlddH2O1000ml每250mlCitratebuffer取Solution117.5mlSolution2107.5ml调pH值至6.0ddH2O125ml封闭液：羊血清+TBST（0.3%Triton-100），即TBST来稀释抗体（稀释倍数视抗体而定）和羊血清（稀释成5%）。4、抗体配制方法：抗体+羊血清+TBST（0.3%Triton-100），即TBST来稀释抗体（稀释倍数视抗体而定）和羊血清（稀释成5%）。5、ABC溶液：【提前30分钟配制，室温放置】A:B=1:1，然后AB:TBST=1:200（注意：A、B与TBST的比例都是1:200，即200ul中加1ulA和1ulB）。6、DAB溶液：【注意避光】【Ni-DAB显色】0.05%DAB+0.25%Nickelammoniumsulfate+0.03%H2O2+0.3%Triton-100+TBS【配1ml工作液：50ul1%DAB+50ul5%Nickelammoniumsulfate+50ul0.6%H2O2+100ulTriton-100+750ulTBS】【DAB显色】0.05%DAB+0.03%H2O2+TBST【配1ml工作液：50ul1%DAB+50ul0.6%H2O2+100ulTriton-100+800ulTBS】0.6%H2O2：用30%H2O2稀释50倍来配0.5MTris-HCl（贮存液）：60.55g溶解于900ml双蒸水中，HCl调pH=7.6，定容至1L。1%DAB（贮存液）：用0.05MTris-HCl溶解DAB粉末（称多少溶多少，大约每次5ml的量即可【最好晚上配制，称量时容易稍微避下光】），配成1%DAB溶液，分装（每EP管1ml）-20oC避光保存（0.5MTris-HCl稀释10倍再用）。【整个过程要避光。配制的容器用棕色瓶子，分装的EP管用锡纸包裹起来】