免疫组织化学及其应用

免疫组织化学及其应用浙江大学病理学与法医学研究所周韧1．免疫组织化学的历史、现状和发展1．1．历史人类的历史有多长，医学的历史也就有多长.医学的任何一个进步都是建立在当时科学与技术发展的相应水平上的.医学的目的:解除人体的病痛核心:诊断和治疗。任何疾病的有效治疗均来源于正确的诊断。疾病的诊断手段准确性，首推病理诊断准确性高，即病理组织学诊断。更准确、更可信、更有权威性。免疫组织化学（以下简称免疫组化）已成为病理诊断中的一种常用手段。病理诊断发展过程的主要事件年代作者事件1632年Severino肿瘤切开后观察的书1661年Malpighi放大镜观察后的报告1761年Morgagni肿瘤与外科方面的书1829年Horner首篇病理论文1832年Hodgkin报告7例尸检结果的论文1858年Virchow发表《细胞病理学》1863年Paget发表《外科病理学》1897年Mallory和Wright发表组织学技术的书1914年Mallory发表《细胞组织学原则》1919年Ewing发表《肿瘤病》1924年McFarland发表《外科病理学》1926年Karsner发表《人体病理学》1928年Papanicolaou发表细胞学方面的书1951年电镜应用于病理诊断1974年免疫组化用于病理诊断诊断病理学开始于19世纪20世纪的第二个25年中达到光学显微镜诊断的辉煌。随之而起的电子显微镜20世纪第三个25年中成为诊断病理的发展高峰。进入20世纪最后25年，取而代之的便是免疫组化了。1．2．免疫组织化学的发展1．2．1．免疫学的发展1．2．2．单克隆技术的出现病理诊断的确立：是找到“特征性”形态表现。常规苏木素伊红（HE）染色几百种的“特殊染色”免疫组织化学产生：抗原抗体结合原理从组织细胞水平进行抗原抗体反应，于是就了免疫组织化学技术。主要的发展过程年代研究者事件1941年Coons实用免疫荧光技术1948年Fagraeus进一步发展免疫荧光技术1970年Sternberger抗体酶标记技术1974年Taylor证实组织中的浆细胞免疫1975年Kohler和Milstein单克隆抗体技术1981年HsuABC法90年代以来SP法，原位杂交及原位PCR免疫组化法诊断免疫组化开始于70年代，发展高峰是80年代，90年代已在国外病理科列入病理技术室的常规工作。国内病理科约晚10年的进程，90年代开始在诊断病理工作中普及。2．免疫组织化学的相关理论和技术2．1．免疫组织化学的工作原理已知的特异性抗体或抗原能特异性结合通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶，金属离子、同位素等，显示一定的信号（如：颜色）借助显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察其颜色变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构抗原和抗体抗原(antigen)1、全抗原(completeantigen)2、半抗原(hapten)抗体(antibody)多克隆抗体(polyclonalantibody)纯化的抗原直接免疫动物（大多数为兔）多个B淋巴细胞克隆所产生的抗体混合物。特异性不如单克隆抗体好，有时会造成抗体的交叉反应但能广泛用于石蜡包埋组织切片。原因是单克隆抗体(monoclonalantibody)单克隆抗体是针对一种抗原决定簇的一个B淋巴细胞克隆分泌的抗体。大多数为小鼠。其优点为特异性强、抗体产量高。单克隆抗体只针对抗原分子的某一个抗原决定簇，这一抗原决定簇可以是抗原分子上的无关抗原决定簇，在免疫组织化学中广泛用于冰冻切片和石蜡切片。单克隆号的来源总之，任何一种免疫组织化学方法，欲获得令人满意的染色结果，除该方法本身所具有的特点（高度敏感）外，还必须选择具有高度特异和稳定的优质抗体。（三）抗原与抗体的关系抗原引起机体产生免疫反应决定免疫反应的特异性产生的抗体、致敏淋巴细胞等物质利用抗体可以检测抗原物质（四）抗原与抗体的反应免疫反应血清学反应。1、抗原与抗体的结合是高度特异性的结合在一定的条件下可以解离。2、一个抗体分子有两个抗原结合点（称两价）一个抗原的分子上则可有许多个结合点（称为多价）。3、抗原的抗体分子的结合，不受两者数量比例的限制，但如需要出现肉眼可见的反应，则抗原与抗体的量需保持一定比例。在抗原或抗体过量的条件下，不能聚合成大颗粒，因此不能出现肉眼可见的反应。（BIGBEE现象）2．2．免疫组织化学的应用范围及优点：2．2．1．应用范围：(1)提高病理诊断准确性(2)对疾病的预后和治疗的意义激素(3)癌基因蛋白的应用(4)对肿瘤增生程度的评价(5)微小病灶的发现微小癌，微小病灶（如羊水栓塞）(6)在肿瘤分期上的意义(7)指导肿瘤的治疗(8)免疫性疾病的辅助诊断(9)病原微生物的检测2．2．2．免疫组化优点：(1)特异性强(2)敏感性高(3)定位准确、形态与功能的结合3．免疫组织化学的常用方法3．1．标本的预处理取材：（原则上）三对照，常用两对照（内对照）保存：-40℃～-80℃固定玻片处理：3．2．抗原修复：抗原破坏的原因抗原修复方法A、化学方法：胰蛋白酶proteinaseB、物理方法单纯加热法：高压加热法：微波方法：（幻灯）柠檬酸盐缓冲液C、修复方法的评价CSA法1:50IgDCSA法1:200IgDCSA法1:500IgDCSA法1:1000IgDCSA法1:5000IgD3．3．常用免疫组织化学方法：A、一步法B、二步法C、三步法D、多步法间接法金银法PAP和BigBeeAPAAPABC法EnVision法BT法（CSA：Catalyzedsignalamplification）1:50、1:200、1:500、1:500、1:1000、1:5000、1:5000,1:106B、二步法C、三步法PAPAPPAPD、多步法E.ABC法F.EnVisionG.CSA法（Catalyzedsignalamplification）BT法CSA原理图CSA法1:50IgDCSA法1:200IgDCSA法1:500IgDCSA法1:1000IgDCSA法1:5000IgDH.免疫组化在细胞凋亡检测中的应用TUNEL法检测凋亡（TerminalDeoxynucleotidylTransferase-mediateddUTPnick-end-labling）TdT介导的dUTP缺口末端标记TUNEL染色：直接法参照德国宝灵曼公司原位末端标记试剂盒操作手册，其主要步骤如下：（1）切片脱蜡至水，双蒸水、PBS液洗；（2）微波处理：切片置于盛有枸椽酸缓冲液（0.01M，PH6.0）的容器中微波加热.（3）PBS液洗5min×3次；（4）每张切片滴加20ug／ml蛋白酶K液，放于湿盒中37℃孵育15min；（5）切片置于0.3%H2O2-甲醇液中室温放置20-25min；（6）滴加TUNEL反应混合液，37℃湿盒中孵育60-90min；TUNEL反应混合液主要成分：Bio-11-dUTPTdT酶（7）PBS液洗5min×3次；（8）滴加链霉菌素—辣根过氧化物酶液（用PBS液稀释成1:200）37℃湿盒中孵育30min，（9）滴加新鲜配制的DAB-H2O2液，镜下观察2-10min显色；（10）自来水充分洗涤；photoesI.免疫组化在原位杂交中的应用3.4重要的染色步骤的要点重要的染色步骤的要点：ABC法（卵白素—生物素—过氧化物酶连结法）ABC法是利用卵白素与生物素特有的高度亲和力这一生物学性质，先将生物素与辣根过氧化物酶(HRP)结合，形成生物素化HRP，然后与卵白素按一定比例混合，形成ABC复合物。用生物素化二抗与第一抗体结合，再与ABC复合物联结形成抗原—抗体—生物素化二抗—ABC。最后用底物显色剂显色。步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；(2)PBS冲洗，5min×3次；(3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min；(4)PBS冲洗，5min×3次；(5)每张切片滴加非免疫动物血清20min；(6)每张切片滴加第一抗体，60min；(7)PBS冲洗，5min×3次；(8)每张切片加滴加生物素化二抗，60min；(9)PBS冲洗，5min×3次；(10)每张切片滴加ABC复合物，60min；(11)PBS冲洗，5min×3次；(12)新鲜配制的DAB溶液，3～10min；(13)自来水冲洗，复染，中性树胶封固。PAP法用第二抗体作“桥梁”，既与第一抗体结合，再与PAP复合物联结，最后用底物显色剂显色。步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；(2)PBS冲洗，5min×3次；(3)3%过氧化氢甲醇溶液，20min；(4)PBS冲洗，5min×3次；(5)每张切片滴加非免疫性动物血清，20min；(6)每张切片滴加第一抗体，60min；(7)PBS冲洗，5min×3次；(8)每张切片滴加第二抗体，60min；(9)PBS冲洗，5min×3次；(10)每张切片滴加PAP复合物，60min；(11)PBS冲洗，5min×3次；(12)新鲜配制的DAB溶液，3～10min；(13)自来水中洗，复染，中性树胶封固。SP法（链霉菌抗生物素蛋白─过氧化物酶连结法）用链霉菌抗生物素蛋白代替ABC复合物中的卵白素蛋白即形成SP法。染色原理同ABC法。国外其他公司亦将此法注册为LSAB法，LAB-SA法和SABC法等。因SP最早建立和报道，其标记技术不断提高，以其稳定染色时间比同类方法短和价格较低而在我国逐渐普及。步骤：(1)石蜡切片脱蜡至水后；(2)PBS冲洗，5min×3次；(3)3%过氧化氢甲醇溶液，10min；(4)PBS冲洗，5min×3次；(5)每张切片加1滴或50μl非免疫性动物血清，10min；(6)每张切片加1滴或50μl的第一抗体，60min；(7)PBS冲洗，5min×3次；(8)每张切片加1滴或50μ生物素标记的第二抗体，10min；(9)PBS冲洗5min×3次；(10)每张切片加1滴或50μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，10min；(11)PBS冲洗5min×3次；(12)每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10min；(13)自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。3．5．各种方法的评价A、不同酶标记敏感性比较B、常用免疫组织化学敏感性比较单纯间接法：优点：1、简单、经济2、无BigBee现象缺点：1、敏感性差2、内源性Ig干扰：二抗是一抗的动物种和类特异的抗体，有可能由于内源性Ig干扰产生背景。PAP法优点：1、高敏感性2、高特异性缺点：1、适应性差，针对不同的种属的一，必须有相应的桥和复合物。2、内源性Ig干扰：①2ndAb接在内源性Ig上，②PAP接在内源性Ig上。3、BigBee效应：bell-shapedcurveABC法：优点：1、高敏感性2、适应性强：同样的ABC复合物可用于各种抗体的检测中3、BigBee效应相对弱些缺点：内源性Ig干扰4．免疫组织化学的质量控制及注意事项4．1．Ab的保存和配制保存性分装即用型配制：选最佳点4．2．正确的设计和结果判断4．2．1．阳性对照：已知的阳性对照4．2．2．内对照：4．2．3．阴性对照：(1)用一个阴性试剂替代一抗或控制步骤目的：用来评价非特异性染色，并较好解释抗原部位的特异性标记。(2)如果大规模使用抗体，一张切片的阴性区，可能就是另一张切片（不同Ab）的非特异性染色对照。正确设计对照方法免疫组化技术设有：阴性对照阳性对照抑制对照吸收对照自身对照在病理科的日常诊断工作中，只要有阴性对照和阳性对照即可。出现假阳性的几种原因1、抗体的稀释度不正确、浓度太高。BigBee现象2、部分多克隆抗体由于特异性等问题将出现异常表达，如S100、Lysozyme、Myoglobin等可在鳞状上皮细胞中表达。出现假阴性的几种原因1、抗体和检则试剂盒配对是否合理。如单克隆抗体（多为鼠），其检测试剂盒应该用鼠的试剂盒，多克隆抗体（多为兔）应该用兔的试剂盒。2、抗体的浓度太低。3、孵育的时间太短。4、固定和温度。5