免疫细胞的分离和保存技术

免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。本法的细胞获得率比自然沉降法高。二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。为此利用一种密度介于1.075～1.092之间而近于等渗的溶液（分层液）做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。常用的分层液有Ficoll和Percoll两种。（一）Ficoll分层液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法。聚蔗糖－泛影葡胺是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物称聚蔗糖（商品名为Ficoll），分子量为40kD，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。高浓度的Ficoll溶液粘性高，易使细胞聚集，故通常使用60g/L的低浓度溶液，密度为1.020，添加比重为1.200的泛影葡胺（urografin）以增加密度。国外常用商品Isopaque或Hypaque，故又称Ficoll-Hypaque分层液，将适量340g/L泛影葡胺加入Ficoll溶液中即可配制成密度合适分层液。分离人外周淋巴细胞以密度为1.077±0.001的分层液最佳，因为人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间。而不同动物血中的单个核细胞对分离液的密度要求各不相同，如小鼠为1.088，马为1.090。分离时先将分层液置试管底层，然后将肝素化全血以Hanks液或PBS液作适当稀释后，轻轻叠加在分层液上面，使两者形成一个清晰的界面。水平式离心后，离心管中会出现几个不同层次的液体和细胞带（图20-1）。红细胞和粒细胞密度大于分层液，同时因红细胞遇到Ficoll而凝集成串钱状而沉积于管底。血小板则因密度小而悬浮于血浆中，唯有与分层液密度相当的单个核细胞密集在血浆层和分层液的界面中，呈白膜状，吸取该层细胞递经洗涤高心重悬。本法分离单个核细胞纯度可达95％，淋巴细胞约占90％～95％，细胞获得率可达80％以上，其高低与室温有关，超过25℃时会影响细胞获得率。（二）Percoll分层液法这是一种连续密度梯度离心分离法。Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，对细胞无毒性。利用Percoll液经高速离心后形成一个连续密度梯度的原理，将密度不等的细胞分离纯化。用Percoll原液(密度1.135)与约等量双离子强度的磷酸缓冲液均匀混合，高速离心后，使分层液形成一个从管底到液面密度逐渐递减的连续密度梯度，再将已制备的单个核细胞悬液轻轻叠加在液面上，低速离心后，便得四个细胞层。表层为死细胞残片和血小板，底层为粒细胞和红细胞，中间有两层，上层富含单个核细胞(75％)，下层富含淋巴细胞(98％)(图-2)。该法是纯化单核细胞和淋巴细胞的一各较好的方法，但操作流程较长，手续较多。图-2连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图三、淋巴细胞及其亚群的分离为研究免疫细胞的功能，常需高纯度的淋巴细胞或其亚群，分离方法介绍如下。（一）、纯淋巴细胞群的采集通常利用单核细胞在37℃和Ca2+存在条件下，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞悬液中去除单核细胞的方法，藉以获得高纯度的淋巴细胞群。（1）粘附贴壁法将已制备的单个核细胞悬液倾于玻璃或塑料平皿或扁平小瓶中，移至37℃温箱静置1h左右，单核细胞和粒细胞均贴于平皿壁上，而未贴壁的非粘附细胞几乎为纯淋巴细胞，继用橡皮刮下贴壁的细胞即为纯单核细胞群。因B细胞也有贴壁现象，用本法分离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。（2）吸附柱过滤法将单个核细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶SephadexG10的柱层中，凡有粘附能力的细胞绝大部分被吸附而粘滞在柱层中，从柱上洗脱下来的细胞主要是淋巴细胞。此法简单易行，对细胞极少损害。（3）磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在单个核细胞悬液中加直径为3μm的羰基铁颗粒，置37℃温箱内短时旋转摇动，待单核细胞充分吞噬羰基铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞。（二）、淋巴细胞亚群的分离分离相当纯化的淋巴细胞亚群是细胞免疫检验的基本技术。其原则是根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。凡根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法；而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞是为阴性选择。常用以下几种方法：（1）E花环沉降法本法是将淋巴细胞与一定比例的绵羊红细胞混合，待淋巴细胞形成E花环后，继用淋巴细胞分层液分离细胞。浮悬在分层界面而不形成E花环的群则富含B细胞，而沉降在管底的形成E花环的细胞用低渗法处理，使围绕细胞周围的绵羊红细胞快速裂解，则获得纯的T细胞。（2）尼龙毛分离法本法利用B细胞和单核细胞具有易粘附于尼龙纤维表面的特性，可将T和B细胞分开。操作原则是取松散而经过处理的尼龙毛（聚酰胺纤维），均匀充填在内径5～6nm的聚乙烯塑料管（饮料管即可）内，经Hanks液浸透保温，将单个核细胞悬液加入柱内，放37温箱静置1～2h。用预温的含10％～20％小牛血清培养液灌洗，洗脱液内含有非粘附的T细胞，重复灌洗几次以除去管内残留的T细胞。再用冷或温培养液边冲边洗边挤压塑料管，此时洗脱液内富含B细胞。如此得到的T细胞纯度在90％以上，B细胞纯度可达80％。（3）亲和板结合分离法利用亲和层析法分离淋巴细胞亚群，其原理是各种淋巴细胞亚群具有不同的抗原性，将相应抗体结合于塑料平板上，继加细胞悬液，凡抗原阳性的细胞则与相应抗体结合，抗原阴性的细胞可从未吸附的细胞悬液中获取（图-3）。同样若用特异性抗原交联在塑料板上，则可分离得具有特异抗原受体的淋巴细胞。淋巴细胞受体与特异抗原或抗体接触，可引起细胞激活，因此，凡欲去除细胞悬液内某一细胞亚群时，本法更适用。如要分离CD4+或CD8+细胞，则可用抗CD4或CD8单克隆抗体吸附。用抗Ig抗体则可分离B细胞。同样，用活化的C3包被，可分离出有C3受体的细胞。图-3亲和分离法图解（4）荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪（fluorescenceactivatedcellsorter，FACS）主要由4部分组成：①细胞流动系统及气压流速控制系统，②激光系统，③检测与讯号处理系统，④细胞分选系统。其主要原理是细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，细胞排成单行，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出时，超声振荡搅动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴（40000个/s），每小滴内最多含一个细胞（其中只有百分之几的液滴中含细胞），细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。如识别的是预计所需的细胞时（如T细胞、B细胞要其亚群），在细胞样品流断裂成小滴时，使液滴瞬即感应阳电荷、阴电荷或不带电荷，使所需的细胞在电场偏转下进入不同的收集管（图-4）。用FACS分离细胞准确快速，能保持细胞活力，并可在无菌条件下进行，但仪器昂贵，极少用于常规，而多数仅作为研究的手段。图-4荧光激活细胞分离仪简图四、吞噬细胞的分离和收集人外周血中单核－巨噬细胞可通过Pecoll密度梯度分离法获取，但数量较少，用血量多。用斑蝥敷贴法可从人体组织液中获取较纯的巨噬细胞，不需作进一步体外分离，细胞量损失较少。该法是用滤纸蘸取10％中药斑蝥酒精浸出液，贴敷在臂内侧皮肤表面，4～5h后皮肤局部充血，48h后局部形成水疱，吸取疱中的组织液，内含巨噬细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感染，应慎用。欲获取小鼠、大鼠、豚鼠等小动物的巨噬细胞，可经腹腔内注入少许石蜡油，3～4天后冲洗出腹腔渗出液，所得细胞悬液中70％～80％为巨噬细胞。五、淋巴细胞的保存和活力测定（一）、分离细胞的保存在某些情况下，分离所得细胞需要加以保存，否则活力迅速下降，甚至死亡。（1）短期保存技术将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMI1640或其他培养液稀释重悬。所用培养液要求等渗，具缓冲作用，并对细胞无毒性。通常置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。（2）长期冷冻保存技术利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，是当前世界上通用的细胞长期保存技术。其原理在于深低温环境可中断细胞的代谢，但在降温过程由于冰晶的形成和渗透压的改变均可导致细胞的损伤和部分死亡，所以在冷冻过程中一定要加用冷冻保护剂，常用的保护剂为二甲亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）。冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。条件合适时，冻存细胞一旦复苏，恢复37℃培养，其形态和代谢活动均可恢复正常。操作的原则是先对需冻存的细胞作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内，速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。继而进行降温冷冻，目前常用两步降温法，即迅速降温至一选择好的临界温作为过渡站，如－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。（二）、细胞活力测定细胞活力常用百分比表示，活力的大小对试验结果有很大影响。细胞活力的测定有许多方法，最简便常用的方法是台盼蓝（trypanblue）染色法。台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。免疫检测试剂中常用的防腐剂有硫柳汞、叠氮钠、抗生素等。1.叠氮钠是HRP的抑制剂，凡是和HRP接触的试剂，一定不能用；2.硫柳汞在ELISA试剂中可普遍使用，但因其有毒，较少使用；3.市面许多试剂盒产品，用抗生素做防腐剂较多，如庆大。4.如果试剂