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胶体金免疫试纸技术在食品兽药残留检测中应用摘要：动物产品中兽药残留是威胁人体健康和影响畜产品质量安全的重要因素。虽然检测兽药残留的方法很多，但皆因其设备昂贵、操作繁琐、费时而受到限制。而胶体金免疫层析技术因其快速、灵敏、简便等特点，在兽药残留检测中广泛研究与应用。论文就胶体免疫层析法的原理，在兽药残留检测中研究应用以及发展前景做了较为详细的阐叙。关键词：胶体免疫层析法；兽药残留；检测引言在残留毒理学意义上比较重要的兽药，按照用途主要有抗微生物类、驱虫类、抗球虫和抗原虫药物、抗生素类生长促进剂、合成代谢荷尔蒙类生长促进剂等[1]。目前，国际上通用的兽药残留检测方法是先采用一种简便的方法对待检样品进行快速初筛，再采用准确性更高的方法对初筛为阳性的样品进行确证分析[2].国内食品受兽药污染问题严重，国家和政府对此已做了大量的投入，但执行情况仍不尽人意，造成该现象的主要原因之一是缺乏快速、灵敏、简便的检测方法[3]。薄层层析、ELISA法、高效液相色谱、质谱检测技术，由于上述方法需借助仪器设备来完成检测过程时间较长不适宜现场快速检测。近年来，胶体金免疫层析法因操作简单，不需辅助仪器和试剂，3~5分钟出结果，并可肉眼判断等特点。因此它在大批量兽药残留现场和初筛检验中得到研究与应用。1胶体金免疫层析法胶体金(colloidalgold)是氯金酸(chloroauricacid)的水溶液，是氯金酸在还原剂如白磷、柠檬酸三钠等的作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定胶体溶液。由于胶体金颗粒具有高电子密度的特性,且颗粒聚集达到一定密度时，出现肉眼可见的粉红色斑点，因而可以作为免疫层析试验的指示物。因此胶体金免疫层析法是一种以胶体（红色）作为示踪标记物[4]。让其与蛋白质等各种大分子物质结合，再利用抗原抗体反应以达到检测目的的一种新型的免疫标记方法。GICA主要包括夹心法和竞争抑制法，夹心法包括双抗体夹心法测抗原和双抗原法测抗体，主要用于病毒、细菌和寄生虫等的检测[5]。竞争抑制法主要用于兽药残留、类固醇、农药等小分子（抗原）的检测[6]。1.1胶体金试纸条胶体金试纸条一般由样品垫、金标垫、层析膜、吸水垫四部分组成。层析材料有硝化纤维膜（NC）、聚酯膜、尼龙膜和PVDF膜等，根据试验需要可选择不同要求的膜，其中NC膜最为常用，使用前可根据试验具体情况确定是否需要活化或处理，多数情况下无需处理，即可直接使用，周文达等[7]通过化学法证明活化后的NC膜可大大提高检测稳定性和灵敏度。将金标蛋白溶液均匀喷涂在金标垫上，于室温下晾干备用。NC膜可捕获一定量的包被（抗体）和二抗作为检测线和质控线。最后将样品垫、金标垫、NC膜和吸水纸依次固定于PVC板，即成试纸条[8]。试纸条与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封保存。密封的测试条室温下一般可保存6~18个月。1.2胶体金免疫层析法检测原理1.2.1竞争法的工作原理[9]待测物与检测线上包被的抗原或抗体竞争结合吸附在金标垫上的金标抗体或抗原。例如，一个阳性样本，待测物与检测线上包被的抗体可竞争结合金标抗体表面有限的抗原位点。随着时间的推移，待测物逐渐增多，结合的金标抗体越多，导致检测线的抗原无法结合到金标抗体。当检测线上的金标抗体少到一定程度时，已经无法达到显色的浓度，此时检测线呈淡色或无色。剩余的金标抗体继续层析，由于质控线上的二抗与抗原不存在竞争位点关系，当金标抗体到达质控线(C线)时，与C线上包被的二抗结合并不断累积，直到显色。所体现的阳性结果为：T线变浅或消失，C线显色;阴性结果为T、C线都显色；检测线和质控线均不显色则为失效。1.2.2双抗体夹心法的工作原理[10]待测物的2个不同抗原位点分别针对单克隆金标抗体和检测线单克隆抗体。例如，一个阳性样本，待测物可同时与金标单抗和检测线单抗结合成一个双抗体夹心待测物的大分子，这个巨型分子由于固定在检测线的单抗上而在检测线聚集，当聚集足够多的胶体金时可被肉眼观察。随着待测物的增多，多余的金标抗体继续层析，质控线包被的是金标抗体的二抗，当多余的金标抗体层析到质控线(C)时，与C线上的二抗结合并不断积累直到显色。所呈现的阳性结果：为C线T线双显色；阴性结果为：T线消失C线显色。检测线和质控线均不显色则为失效。1.2.3间接法的工作原理[11]间接法一般用于检测抗体，与双抗体夹心法有相同的原理，不同的是以待测抗体的抗原蛋白包被检测线，以待测抗体的多克隆抗体包被胶体金，以金标抗体的二抗包被检测线。检测过程中，例如一个阳性样本，待测样本中的抗体先与金标多克隆抗体结合，经过检测线上包被的抗原时，待测抗体与抗原结合，不断积累胶体金直至发出显色信号。多余的金标多克隆抗体层析至质控线时与包被在质控线的金标多抗的二抗结合，累积后显色。所呈现的阳性结果为T线C线双显色；阴性结果为：T线消失，C线显色。2食品兽药残留检测中应用2.1抗生素残留检测自青霉素发现以来，各国对抗生素的研究不断发展。抗生素作为预防和治疗动物疾病的药物被大量不合理使用，造成抗生素残留。畜禽产品中抗生素残留危害人类健康，主要表现为毒性作用，细菌耐药性、过敏与变态反应、致畸、致癌和致突变作用等方面。因此，不管是食品卫生还是动物检疫部门，抗生素残留的检测十分重要。陶光灿等[12]建立了检测猪肉、鸡肉中氯霉素残留的胶体金免疫层析方法。检测限均达到0.3ug/kg，特异性高，检测结果与液相色谱-串联质谱法基本一致。何丹婷等[13]研制了快速筛查检测牛奶中恩诺沙星的胶体金免疫层析试纸，其对牛奶样本的检测限为50ug/L，特异性强，可用于牛奶中快速筛查检测恩诺沙星。范国英等[14]以分泌抗链霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立为基础，应用GICA成功研制出SM残留快速检测试纸条。此试纸条的检测限为8ug/L，检测上限为100ug/L，与双氢链霉素的交叉反应为100%，与其他抗生素无交叉反应。2.2磺胺类药物残留检测磺胺类药物是人工合成的一系列抗菌药物的总称。因抗菌谱广、价格低廉、广泛应用于动物生产中。可溶性磺胺类药物经口服可迅速到达全身，并易在动物体内残留，长期食用此类肉品，可影响人的中枢神经系统，引起泌尿道损害、造血功能障碍、过敏反应、耐药性等。王钱等[15]研制了用于快速检测猪肉组织中磺胺甲噁唑残留的胶体金免疫层析检测试剂.检测下限可达20ug/L，且与磺胺嘧啶、盐酸克伦特罗、四环素、青霉素无交叉反应。检测试剂具有较高的灵敏度及特异性。张佳宜等[16]制备了快速检测猪肉及牛奶中磺胺二甲嘧啶的胶体金免疫层析试纸条，检出限为1ug/L，与高效液相色谱法（HPLC）对比检测猪肉和牛奶样品，检测一致性好，适用于动物源性食品中磺胺二甲嘧啶残留的大批量现场检测。2.3呋喃类药物残留检测呋喃类药物与蛋白结合的产物能在体内稳定的残留，具有潜在的致癌和诱导突变的作用。该类物质检测常以其代谢产物作为残留标示物。我国农业部规定动物性食品中不得检出呋喃唑酮。徐霞玲等[17]应用免疫竞争胶体金层析原理，研制了检测猪肉中呋喃妥因代谢物1-氨基乙内酰脲(AHD)免疫试纸条。该试纸条对AHD的最低检测限为2.33ug/L，除与呋喃妥因有弱交叉外，与其他同类物均无交叉反应，灵敏度高，简便快速。赵正苗等[18]应用胶体金免疫层析法检测鸡肉，猪肉中残留的呋喃西林代谢物。首次将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中，使金标抗体与待检样品液充分接触，增加整个体系的反应灵敏度，该试纸条检测限1.0ug/L，假阳性率小5%，假阴性率为0，特异性高，与其他药物无交叉反应。2.4β-兴奋剂残留检测2002年到2010年，我国农业部先后发布了《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》，《关于发布食品动物禁用的兽药及其他化合物清单的通知》和《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质名单》明确禁止在养殖动物上使用的β-兴奋剂共16种[19]。然而，由于利益驱动，在饲料或动物饲养过程中违法使用Β-兴奋剂的现象屡禁不止。目前，我国动物检验部门主要通过对动物尿液、肌肉内脏、血浆、粪便等进行检测，判断食品动物体内是否有Β-兴奋剂[20]。刘见[21]将盐酸克伦特罗（CL）通过一定方法免疫动物后获得高效价的特异性抗体，用胶体金标记抗体后制备成试纸条，对CLB的最小检测量为40ug/L与ELISA试剂盒测定的89份阴性样品和40份阳性样品的结果对比，其符合率分别达到100%和95.2%。李超辉等[22]建立了胶体金免疫层析试纸条T/C比值法定量快速检测猪肉中克伦特罗残留的方法，检测灵敏度0.19ug/kg，与传统ELISA有较好的相关性，可用于猪肉组织样品中克伦特罗的快速及定量检测。蒋蔚等[23]通过确定最佳抗体标记量，检测线和质控线浓度，研制一种快速检测猪尿中莱克多巴胺残留的胶体金免疫层析试纸条，检测限为5ug/L，8-10min内完成测试，适用于现场快速检测莱克多巴胺残留。LiHM等[24]研制了以荧光纳米硅为基础的盐酸克伦特罗胶体金免疫试纸条，可快速、定量的检测CLB的残留量。该试纸条检测限可达到0.28ug/L~3.3ug/L，CLB的的回收率可达到81.7%-107%，可快速、灵敏和定量检测猪尿液中的CLB残留。3问题与前景展望GLCA以其敏感性高、特异性强、易于肉眼判断、简便快速、不需辅助仪器和试剂、结果易于保存等特点，特别适合基层和现场使用。目前，GLCA在实际研究与应用过程中仍存在一些问题：即在检测过程中常出现假阳性和假阴性问题，以及检测的灵敏度，可重复性，检测范围有限等[25]。因此，GLCA还值得进一步研究，优化改进其检测方法与技术。3.1进一步提高检测的灵敏度和范围GLCA与ELISA的检测灵敏度相近，可达到1ug/L或更低水平。但有些试验的灵敏度却较低，灵敏度的提高将会进一步拓宽GLCA的检测范围，如采用信号放大系统如生物素亲和素系统，是提高GLCA检测灵敏度的有效方法之一。另外可以采用一些新标记物,并结合一些相应的简单检测仪器是比较有希望的途径。3.2实现多元检测采用多种项目测定和多项目的组合测定固定于同一膜上的两种方式，一次检测可同时得到一组结果，缩短检测时间及节省成本。王自良等[26]用细胞融合技术筛选克伦特罗(CL)和莱克多巴胺(RAC)杂交瘤细胞株，在结合垫上灌注CL和RAC两种金标单克隆抗体，双检测线上喷涂抗原CL-OVA和RAC-BSA制成同时检测CL和RAC的胶体金免疫层析试纸条，该试纸条已在猪场推广应用。3.3实现半定量或定量检测目前拥有胶体金定量检测的方法包括根据显色强度应用简单仪器进行定量或通过应用不同灵敏度受体固定量的方式，观察显色情况，以实现半定量检测。一方面可以通过精确控制样品加入量的条件下，通过确定检测带的显色时间对待测物进行定量。这种定量方式以样品中待测物含量与检测带显色时间之间存在一定对应关系为基础。另一方面还可通过复合多条不同灵敏度层析条的方式，通过观察各层析条的显色情况,将待测物含量确定于某一浓度区间，从而实现半定量检测。参考文献：[1]吴永宁,邵兵,沈建忠.兽药残留检测与监控技术[M].北京:化学工业出版社,2007.[2]魏文平,龚振明.胶体金免疫层析法检测兽药残留的原理和方法[J].黑龙江畜牧兽医,2007(8)9：41-43.[3]刘丽强.19-去甲睾酮胶体金免疫层析试纸条的研制[D].无锡:江南大学,2007.[4]方钲.磺胺对甲氧嘧啶胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制[D].扬州:扬州学,2010[5]DENGXY,GAODJ,TIANY.etal.ApplicationofColloidalGoldtoFluorophotometricDeterminationofHumanIgG[J].CHEM.RES.CHINESEUNIVERSITIES,2010,26(1):23—26.[6]TAOJ,ZHONGL,etal.ASimpleandRapidColloidalGold-basedImmunochromatogarpicStripTestforDetectionofFMDVSerotyp