血脂测定及方法学评价

血脂测定及方法学评价基本内容1.基本概念2.血脂测定的常规要求3.血浆脂质测定4.血浆脂蛋白测定5.载脂蛋白测定6.血浆脂蛋白代谢相关蛋白质与酶的测定7.基因突变分析基本概念•血脂•血浆脂蛋白•载脂蛋白•脂蛋白受体•HDL-C、LDL-C、VLDL-C血脂1.定义：指血清/浆中所有脂类物质。2.种类：总胆固醇（游离胆固醇FC＋胆固醇酯CE）甘油三酯磷脂糖脂游离脂肪酸类固醇固醇血浆脂蛋白（lipoprotein,LP）•定义•共同特征•分类血浆脂蛋白（lipoprotein,LP）•定义：脂类不溶或微溶于水，无论是内源性或外源性脂类均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式在血液循环中运输。LP•共同特征：核心：不溶于水的TG和CE外壳：少量蛋白质和极性的PL、FFA桥梁：PL的极性部分与Prot结合，非极性部分与其他脂类结合LP•分类：超速离心法：CM→VLDL→LDL→HDL→Alb-FFAcomplex琼脂糖电泳法：CM→β→前β→α即：CM→VLDL→IDL→LDL→LP(a)→HDLCM前ββ前βα载脂蛋白(apolipoprotein,apoprotein,Apo)•定义：脂蛋白中的蛋白质部分，具有结合及转运脂质、稳定LP，作为脂蛋白受体的配体，参与脂蛋白与细胞表面脂蛋白受体的结合及其代谢过程，激活某些与血浆脂蛋白代谢有关的酶类等作用。•分类：ApoA、B、C、D、E、H、J、（a）ApoA（AⅠ、AⅡ、AⅣ）ApoB（B100、B48）ApoC（CⅠ、CⅡ、CⅢ0~2）脂蛋白受体•定义：一类位于细胞膜上的糖蛋白。以高度的亲和方式与相应的脂蛋白配体作用，从而介导细胞对LP的摄取与代谢，进一步调节细胞外LP的水平。•类型：LDL受体VLDL受体清道夫受体HDL-C、LDL-C、VLDL-C•在LP中有prot、ch、PL等，其中ch含量较为稳定，目前以测定LP中ch含量的方法作为LP的定量依据。血脂测定的常规要求•在显著改变饮食习惯后应等待3~6个月测血脂，同时要求体重恒定。•采血前12h不要饮酒、咖啡、奶•病人禁食12h以上，采取静脉血（止血带使用不多于1min），采血时病人取坐位或半卧位（抽血前至少静坐5min，站立使血脂↑）•血脂与年龄、性别、种族等生物因素有关•血脂与饮食习惯、吸烟、运动及应激等生活方式有关•血脂与临床（疾病、药物）有关•血脂与血标本采集与处理有关•一般多用血清标本，用血浆时选用EDTA-Na2抗凝，不用肝素•四个基本指标（TC、TG、HDL-C、LDL-C）在4℃保存3天，-20℃稳定数周，-70℃以下长期保存•一次检查结果可疑应几周后复查再作诊断血浆脂质测定•1.总脂质测定•2.总胆固醇（TC）测定•3.甘油三酯（TG）测定•4.磷脂测定•5.游离脂肪酸测定总脂质测定•方法：1.脂质抽提法2.直接测定法总胆固醇（TC）测定•CE占70%，FC占30%•分布：LDL中最多其次是HDL和VLDLCM最少•意义：TC高低通常反映LDL-C的高低，但在一定程度上也受HDL-C和VLDL-C水平的影响。总胆固醇（TC）测定方法•同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）：决定性方法•化学法：其中ALBK法为参考方法•酶法：其中胆固醇氧化酶法为常规方法TC测定的化学试剂显色法（强酸试剂显色法）•步骤：1.抽提（正己烷、乙醇、石油醚等）↓2.皂化（KOH）↓3.洋地黄皂苷沉淀纯化↓4.显色比色Zak反应：ch+浓h2so4+Fe3++冰醋酸→紫色（563nm）L-B反应：ch+浓h2so4+醋酸酐+冰醋酸→绿色（410nm）•四步法•三步法（正己烷抽提L-B反应显色为公认的参考方法）•二步法•一步法：其中LB反应直接法为常规方法TC测定的胆固醇氧化酶法•原理：CE胆固醇酯酶（CHE）FC＋FFAch＋O2胆固醇氧化酶（COD）胆烷-4-烯-3-酮＋H2O2氧电极240nm比色Trinder反应（即CHOD-PAP法，最常用）评价：快速、准确、标本用量少，便于自动化。TG测定•分布：主要存在于CM及VLDL中，但空腹血中出现CM是少见的，故空腹血中TG↑代表VLDL↑。•方法：化学法：操作烦琐，影响因素多，准确性差，现较少采用。酶法：操作简便，快速准确，可在自动化仪器上批量测定。化学法测定TG•基本步骤：抽提：提取TG，去除PL、游离甘油、Glu等干扰常选用正壬烷/正庚烷-异丙醇-稀硫酸抽提剂皂化：KOH水解甘油TG甘油甲醛＋甲酸HIO4氧化：显色：A.变色酸显色法：氯仿提取变色酸显色法为常规方法B.乙酰丙酮显色法：较简便，常用方法C.盐酸苯肼-高铁氰化钾法D.三氮唑法乙酰丙酮显色法Hantgsch反应：甲醛＋乙酰丙酮NH4+3,5-二乙酰-1,4-二氢二甲基吡啶（带黄色的荧光物质，λ412nm)CDC认为变色酸法与乙酰丙酮荧光法可以为参考方法酶法测TG小结：TGLPL甘油甘油激酶法：（GK)甘油＋ATPGK3-磷酸甘油＋ADP磷酸甘油脱氢酶法磷酸甘油氧化酶法丙酮酸激酶-LDH法甘油脱氢酶法甘油氧化酶法磷酸甘油氧化酶法测TG•原理：TG+H2O脂蛋白酯酶（LPL）甘油＋FFA甘油＋ATP甘油激酶（GK）Mg2+甘油-3-P＋ADP甘油-3-P＋O2磷酸甘油氧化酶（GPO）磷酸二羟丙酮+H2O2H2O2＋4-AAP+4-氯酚POD醌亚胺＋H2O＋HCL评价：准确、灵敏，试剂稳定，线性范围较宽。但要设空白去除FG的干扰。其中两步法为中华医学会检验分会的推荐方法。甘油氧化酶法测TG第一步反应：去除游离甘油（FG）FG+O2甘油氧化酶(GlyOD)甘油醛+H2O2H2O2+EMAEPOD无色物质第二步反应：测定TG。在第一步反应3～5min后进行TG+3H2OLPL甘油+FFA甘油+O2甘油氧化酶(GlyOD)甘油醛+H2O2H2O2+4-AAP+EMAEPOD有色物质磷脂测定•化学法•酶法FFA测定•酶法•滴定法•比色法•AAS•HPLC血浆脂蛋白测定•通常认为HDL是动脉粥样硬化的防御因素•通常认为LDL是动脉粥样硬化的致病因素这两类LP的测定是测其所含的胆固醇（HDL-C与LDL-C）•LP(a)的水平高是心脑血管病的独立危险因素血浆脂蛋白测定•1.超速离心分离纯化法：多为CDC的参考方法•2.电泳分离法：主要用于定性•3.血浆静置实验：详见临床生化理论课•4.血浆脂蛋白胆固醇测定：1)HDL-C2)LDL-C3)LP(a)沉淀分离LP•原理：由于LP的组成与理化性质不同，在不同的聚阴离子（PEG、肝素、磷钨酸等）和不同2价金属离子以及不同PH值条件下，使LP与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离测定的目的。•举例：肝素-Mn2+沉淀LDL与VLDL磷钨酸钠-Mg2+沉淀LDL与VLDL聚乙烯硫酸盐沉淀LDLHDL-C测定•化学沉淀法：磷钨酸-Mg2+沉淀法为常规方法•均相测定法•免疫法LDL-C测定•计算法：LDL-C=TC-[HDL-C+(TG1/5)]•化学沉淀法：聚乙烯硫酸盐沉淀法(PVS)为常规方法•免疫分离法：准确、精密，但成本高•匀相测定法：表面活性剂消除法目前应用最广LP(a)测定•免疫法：ITA、INA、ELISA、RIA、RID等•LP(a)-C测定法：超速离心法、麦胚血凝素法、琼脂糖电泳法等Apo测定•电泳法•免疫法•层析法•ApoAⅠ、AⅡ、B100、CⅡ、CⅢ、Ｅ、（ａ）均为常规检测项目。完