产酶微生物的分离与应用

产酶微生物的分离与应用摘要：介绍了环境中产酶微生物尤其是产纤维素酶和漆酶的真菌和细菌种类，并将产酶细菌和真菌的做了对比，阐述了从环境中分离产酶微生物的方法及菌株和产物的鉴定方法。以及特别罗列了纤维素酶在制浆造纸、饲料工业、污水治理、纺织洗涤、食品和堆肥等领域的应用情况。最后，展望了酶的应用领域和未来研究方向。关键词：产纤维素酶微生物；纤维素酶；菌株分离；菌株鉴定；酶活测定；纤维素酶应用领域SeparationandapplicationofenzymeproducingmicroorganismsYangFeng-ping(Collegeoflifescience,NanjingNormalUniversity)Abstract:Thispaperintroducestheenzymeproducingmicroorganismintheenvironmentespeciallyspeciesoffungiandbacteriaproducingcellulaseandlaccase,andtheenzymeproducingbacteriaandfungiwerecompared,expoundsthemethodofisolationandidentificationmethodsofenzymeproducingmicrofloraandstrainsfromtheenvironmentandproduct.Andspecialliststheapplicationofcellulaseinpulpingandpapermaking,feedindustry,sewagetreatment,textilewashing,foodandcompostetc..Finally,prospectsofthefieldofenzymeandfutureresearch.Keywords:cellulaseproducingmicroorganisms;cellulase;Strainsisolated;strainidentificatio-n;enzymeactivitydetermination;cellulaseapplicationfield自然界中蕴藏着巨大的微生物资源，它们散布于整个地球的各个角落，而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式，能分解利用不同的底物。这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。特别是当基因工程介入时，动植物细胞中存在的酶，几乎都能够利用微生物细胞获得。因此，有计划和仔细地筛选微生物菌种，通常可以获得能够生产几乎任何一种酶的适当菌株。土壤和海水这两大类资源宝库的开发具有重要意义。我们可以从土壤、腐木筛选相应的产酶微生物，从污水中筛选各种能够产生分解糖类、脂类、蛋白质、纤维素、木质素、环烃、芳香物质、有机磷农药、氰化物及某些人工合成的聚合物酶的微生物[1]。在极端环境可筛选嗜热微生物、嗜碱微生物、嗜盐微生物、嗜酸微生物、耐高压微生物等，并开发极端微生物酶品种。进入21世纪以来，各国已在生物产业研究中投入了巨大的财力和科研力量。随着能源、资源和环境问题的日趋严重，生物资源利用已被全球广泛重视，成为世界各国的战略性研究重点。在自然界中，纤维素类物质是最廉价、最丰富的一类可再生资源，是人类社会赖以生存的基本物质来源。全世界植物体生成量每年高达1500亿t干物质，其中有50%以上为纤维素和半纤维素[2]。采用生物酶催化技术可将农作物、树木和其他植物及其残体、畜禽粪便、有机废弃物等生物质转化为工业原料，达到合理、可循环利用自然生物资源的目的。担子菌亚门(Basidiomycotina)、层菌纲(Hymenomycetes)、半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycets)和子囊菌亚门(Ascomycotina)的部分真菌都具有很强的产生纤维素酶和漆酶的能力，备受生化工业领域的关注。其中，白腐菌、褐腐菌和软腐菌是自然界中降解木材的主要真菌[3]。在过去的30多年里，有关白腐菌的研究主要集中在木素降解酶系方面；有关软腐菌的研究则集中在纤维素降解酶系方面；而有关褐腐菌的研究主要集中在降解木质纤维素机制方面。其中，研究最多的为黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)及其所产生的木素过氧化物酶(Ligninperoxidase，简称LiP)和锰过氧化(Mn-dependentperoxidase，简称MnP)及漆酶对芳香化合物的降解能力[4]。纤维素酶在食品、饲料、医药、纺织、洗涤剂和造纸等众多工业领域具有广泛的应用价值。按照酶的作用特性可将纤维素酶分为碱性纤维素酶和酸性纤维素酶2大类[5]。目前，很多能够产生纤维素酶和漆酶的生物资源尚未得到充分的开发和利用，鉴于此，笔者简述了自然界中的产酶微生物及其应用领域。1产酶微生物1.1产酶真菌担子菌、子囊菌和半知菌是产生纤维素酶和漆酶的主要菌种，虽然不同菌种产生的酶和作用底物具有差异，使用目的也不同，但其所产酶服务人类的目的是相同的，即提高自然界现有资源的利用率。目前，已研究过的产酶微生物有[6]：1.1.11担子菌黄孢原毛平革菌、彩绒革盖菌、毛云芝菌、粗毛盖菌、三色革裥菌、射脉菌、凤尾菇、糙皮侧耳、朱红密孔菌、血红栓菌、多孔菌、冬拟多孔菌、层孔菌、豹斑革耳、偏肿拟栓菌、密粘褶、硫色绚孔菌、茯苓、卧孔菌、灵芝、蜜环菌、双孢菇、从孢薪菇、灰盖鬼伞、金针菇、平菇、糙皮侧耳、茶薪菇、洁丽香菇、香菇。1.1.2半知菌腐皮镰孢、绿色木霉、里氏木霉、康氏木霉、黑曲霉、构巢曲霉、绳状青霉、变幻青霉、灰腐质霉、细粘束孢霉。1.1.3子囊菌长喙壳、嗜热毛壳菌、疣孢漆斑菌、嗜热子囊菌。真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸条件下水解纤维素底物。真菌纤维素酶通常为胞外酶，酶被分泌到培养基中，用过滤和离心等方法可较容易地得到无细胞酶制品。目前，木霉、里氏木霉和黑曲霉，是生产饲用纤维素酶的主要真菌，也是公认的安全微生物，不产生毒素、产量高、酶系全、活性高、较稳定，是应用最广的纤维素酶生产菌。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，均属于蓝色多铜氧化酶家族。漆酶在自然界中分布于多种植物、真菌，少数昆虫和细菌中分泌漆酶的真菌主要为担子菌亚门的白腐真菌。1.2产酶细菌纤维素分解性细菌广泛存在于腐植土、木材、枯枝落叶和草、木本植物体内，又分为好氧性细菌和厌氧性细菌。好氧性细菌如纤维单胞菌属、纤维弧菌属、噬胞菌属等可分解纤维素；而厌氧条件下纤维素分解过程中，一些厌氧性的芽孢梭菌属的细菌起到了重要作用。此外，枯草杆菌、假单孢杆菌和纤维单孢菌可产生胞外内切纤维素酶[7]。2真菌和细菌产生酶的差异细菌的纤维素酶存在于细胞内，当纤维素与细胞接触时才能被分解，这种酶不易从培养基中提取出来。真菌的纤维素酶为胞外酶，可分泌到细胞体外进入培养介质中，容易被提取，可制成酶制剂，在各种酶解生产中广泛使用。真菌和细菌纤维素酶的纤维素结合结构域(CelluloseBindingDomain简称CBD)的三维结构不同，真菌CBD由33~36个氨基酸组成，具有高度同源性，而细菌CBD由100~110个氨基酸组成，同源性较低。真菌外切酶的CBD结构形状呈/楔型0，一面亲水，另一面疏水。真菌纤维素酶合成后分泌到胞外，其对纤维素的降解是内、外切酶之间的协同作用。而细菌(枯草杆菌、假单孢杆菌、纤维单孢菌)可产生胞外内切纤维素酶，但无外切纤维素酶的形成。通常，细菌纤维素酶的降解效率低于真菌[8]。细菌纤维素酶产量少、活性低、酶系单一，不能分泌到胞外。丝状真菌具有诸多优点:¹产生纤维素酶为胞外酶，便于分离和提取；产酶效率高，产生纤维素酶的酶系结构较合理，相互间可发生强烈的协同作用；可同时产生许多半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等。大部分真菌产酸性纤维素酶，有利于在畜禽胃肠道内发挥作用，所以目前饲用纤维素酶大多来源于真菌[9]。试验结果表明，由真菌和细菌组成的混合菌分解纤维素的能力明显强于其中任何一种单一菌株。3产酶微生物的分离鉴定3.1采样用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5—25cm处的土样10—25g，装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10—30cm处取样。给塑料袋编号并记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件[10]。一般样品取回后应马上分离，如果不能及时分离，则可事先用选择性培养基做好试管斜面，随身带走。3.1.1土壤有机质含量和通气状况5—25cm土层，适合微生物生长，每克土中含菌数约几十万到几十亿个。酵母菌分布土层最浅，约5—10cm，霉菌和好氧芽孢杆菌也分布在浅土层。3.1.2地理条件南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多，特别是热带和亚热带地区的土壤。3.1.3土壤酸碱度和植被状况偏碱土壤环境，适合于细菌、放线菌生长。偏酸的土壤环境下，霉菌、酵母菌生长旺盛。植物根部的分泌物有所不同，即植被对微生物分布也有一定的影响。如葡萄或其他果树在果实成熟时，其根部附近土壤中酵母菌数量增多[11]。3.1.4季节条件不同季节微生物数量有明显的变化，冬季温度低，气候干燥，微生物生长缓慢，数量最少。到了春天随着气温的升高，微生物生长旺盛，数量逐渐增加。由于气候条件在南方秋季采土样最为理想。3.1.5根据微生物营养类型每种微生物对碳、氮源的需求不一样，分布也有差异。微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。森林土富含纤维素，适合纤维素酶产生菌的生长。3.1.6根据微生物的生理特性在筛选一些具有特殊性质的微生物时，需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。筛选高温酶产生菌时，通常到温度较高的南方，或温泉、火上爆发处及北方的堆肥中采样；3.2富集培养富集培养是在目的微生物含量较少时，根据微生物的生理特点，设计一种选择性培养基，创造有利的生长条件，使目的微生物在最适的环境下迅速地生长繁殖，数量增加，由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种，以利分离到所需要的菌株。富集培养主要根据微生物的碳、氮源、pH、温度、需氧等生理因素加以控制[12]。富集产纤维素酶的菌时就需要一纤维素为唯一碳源富集纤维素降解菌。3.3初筛通常是将分离出的菌种移植在一定组分的培养基上，此培养基成分需有筛选作用，用固体或液体培养基进行培养，鉴定培养的是否为目标菌。鉴别的方法常用有四类，分别是透明圈法、变色圈法、生长圈法、抑制圈法。筛选纤维素降解菌时一般在培养基中加入刚果红，这样当所培养的菌降解了培养基中的纤维素时就会在培养基上形成透明圈[13]。3.4复筛为了从初筛得到的微生物中筛选高产菌株需要对每一个菌株，用接近于生产的培养条件进行复筛，再测定培养物的酶活力。复筛时一般选用1-2种培养基，在固定培养条件下对每一个菌株进行复筛。菌株多时对每一个菌株做一份实验，从中择优汰劣。3.5菌株鉴定和产物鉴定3.5.1菌落特征观察将菌株接种在适宜培养基上培养，之后连续观察上面的菌株生长过程中菌落的表面平坦或是突出，边缘粗糙或整齐，质地均均匀与否，正反面颜色是否相同，气味的有无及味道如何，菌落形状和大小及菌株个体形态等特征[14]。然后根据《真菌鉴定手册》或《伯杰氏细菌鉴定手册》进行分析鉴定。3.5.2分子生物学鉴定对细菌菌株的16SrRNA真菌菌株的18SrRNA序列进行测序，并同GenBank中序列进行比对.确定未知种与同属种之间的亲缘关系。3.5.3产物酶的酶活测定酶活力测定常用的方法有终点法和动力学方法。动力学方法包括比色法、量气法、滴定法、分光光度法、放射测量法、酶偶联分析。其中分光光度法最常用，几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。它是利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。纤维素酶是一组酶的总称包括：滤纸酶、β-葡聚糖苷酶、内切葡聚糖(CMC)酶、外切葡聚(CBH)酶[15]。所以测定纤维素酶的活力需要测定这四种酶的酶活。4.酶的应用领域——以纤维素酶为例白腐菌降解机制