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产青霉素酶菌种的分离、诱导及活性测定实验报告摘要：目的：掌握诱导细菌高产青霉素酶的方法，获得高产酶的菌株，以进一步对青霉素酶进行研究，从而在细菌耐药性上获得新的突破。方法：分别用20u、1000u、2000u、4000u、10000u、20000u的青霉素在平板上进行诱导删选，最终获得耐10000u青霉素菌，并进行紫外诱变，摇床48h后进行酶活力的测定。结果：酶活力测定为22260单位，紫外照射后未得到菌种。结论：从土壤中提取了可以产青霉素酶菌种，经检验为球杆状菌种。关键字：青霉素酶；菌种分离；紫外诱变前言：青霉素酶又称β-内酰胺酶(β-lactamase,EC3.5.2.6),可水解β-内酰胺类抗生素。虽然细菌产生青霉素酶是导致耐药性出现的原因之一,但利用青霉素酶具有水解β-内酰胺类抗生素的特点,可将其用于抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选。枯草芽孢杆菌是常见的青霉素酶分泌菌种，革兰氏阳性菌，属芽孢杆菌。无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普通，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，紫外线的波长在200-380nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253-265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。在进行酶活力诱导时，通常利用青霉素分子不消耗碘，而其降解产物消耗碘的性质，采用剩余碘量法测定，以标准对照法计算含量。青霉素在碱性条件下水解，生成的青霉噻唑酸在酸性条件下与定量过量的碘作用，剩余的碘用硫代硫酸钠滴定，同时做空白试验。由于青霉素被碘氧化的反应受温度、PH、时间等诸多因素影响，耗碘量没有固定的摩尔关系，尤其是温度影响，因此实验过程中要严格控制温度，同时采用与青霉素标准品平行的对照测定，以抵消上述可变因素的影响。1材料与方法1.1材料1.1.1药品160万单位/0.96g青霉素、硫代硫酸钠、碘，、可用性淀粉，蛋白胨、牛肉膏、氯化钠、蒸馏水、琼脂、甘油、氯化钠、0.1％硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)溶液、枸橼酸钠、20％硫酸镁(MgSO4·7H2O)溶液、磷酸氢二钾、酵母提取物。1.1.2仪器和其他用品试管、三角瓶、接种环、三角棒、培养皿、烧杯、滴定管、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、37℃恒温培养箱、恒温摇床、pH试纸（pH5.5—9.0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、移液枪（20μL、200μL、1000μL）、枪头1.2方法1.2.1菌种的筛选取一个土壤样品10g,用10ml去离子水稀释搅拌静置取1ml上层液用去离子水稀释1000倍为菌样品。配制细菌试管液体培养基，每试管5ml共配制15只，灭菌。向试管分别加入青霉素使其分别为10μ、20μ、50μ、100μ,200μ、500μ、1000μ、2000μ、5000μ、10000μ的青霉素单位。将菌样品从10μ逐步诱导至10000μ单位，取10000μ单位下的细菌保存菌种。细菌培养基：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化钠4g蒸馏水1000mL（若为固体培养基，加20g琼脂），pH7.41.2.2酶活力的测定取菌体平板培养物，接种至发酵培养基内，在25℃摇床培养24小时，取摇瓶培养基中菌液15ml，4000r/min冷冻离心20min，沉淀菌体，调节pH值至约8.5,用滤柱滤过除菌，滤液用无菌操作调pH值至近中性后，分装于适宜容器内，在10°C以下贮存称取青霉素钠（钾）适量，用磷酸盐缓冲液(pH7.0)，溶解成每1ml中含青霉素1万单位的溶液。另取粗酶溶液，按估计单位用磷酸盐缓冲液(pH7.0)稀释1000倍，在37℃预热。精密量取青霉素溶液50ml,置100ml量瓶中，预热至37℃后，精密加入已预热的青霉素酶稀释液25ml，迅速混匀，在37℃准确放置1小时，精密量取3ml，立即加至已精密量取的碘滴定液(0.01mol/L)［精密量取碘滴定液(0.1mol/L)10ml，置100ml量瓶中，用醋酸钠缓冲液(pH4.5)稀释至刻度］25ml中,在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定，至近终点时，加淀粉指示液，继续滴定至颜色消失。取已预热的青霉素溶液2ml，在37℃放置1小时，精密加入上述碘滴定液(0.01mol/L)25ml，然后精密加粗酶稀释液1ml，在室温暗处放置15分钟，用硫代硫酸钠滴定液(0.01mol/L)滴定。得空白滴定消耗。按下式计算：E＝(B－A)×M×F×D×100式中E为青霉素酶活力，单位／(ml.小时)；B为空白滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；A为样品滴定所消耗的上述硫代硫酸钠滴定液的容量，ml；M为硫代硫酸钠滴定液的浓度，mol/L；F为在相同条件下，每1ml的上述碘滴定液(0.01mol/L)相当于青霉素的效价单位（742）D为青霉素酶溶液的稀释倍数。注：磷酸盐缓冲液(pH7.0)取磷酸氢二钾7.36g与磷酸二氢钾3.14g,加水成1000ml。醋酸钠缓冲液(pH4.5)取冰醋酸13.86ml,加水使成250ml；另取结晶醋酸钠27.30g,加水使成200ml，两液混合均匀。碘滴定液称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释至1000mL，摇匀贮存于棕色瓶。发酵培养基：牛肉膏：3g蛋白胨：15g0.1%硫酸亚铁(FeS04•7H20)溶液：0.5ml氯化钠：4g枸橼酸钠：5.88g20%硫酸镁（MgS04•7H20)溶液：lml磷酸氢二钾：4g甘油：50g水：1000ml1.2.3紫外诱变将之前保种的10000单位的菌种接种在250ml液体培养基里面摇床培养18h，试管里的菌液稀释到100万单位/ml，稀释后的菌液平铺（约取3ml)在6个灭菌的空平板上，分别于紫外等下照射0min、1min、3min、5min、7min、9min。取照射后的菌液分别涂布在含有青霉素10000单位/ml、15000单位/ml的固体培养基上，于37℃培养箱保存，之后观察菌落生长情况。挑取长出来的菌落在液体培养基里面培养48h，取培养液进行测酶活，得出结论。培养基的配置（100ml）：蛋白胨1.0g氯化钠1.0g牛肉膏0.5g琼脂粉1.0-2.5g1.2.4菌落镜检方法用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，涂培养基中生长良好的菌落，做成浓菌悬液。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定，以不烫手为宜。用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加结晶紫染液1-2min。水洗去涂片上的染色液。将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，注意勿将菌体擦掉。先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。2结果与讨论2.1结果2.1.1筛选结果图1:50单位培养结果图2:500单位培养结果图3:1000至10000单位2.1.2酶活测定结果结果数据记录：粗酶液稀释100倍滴定刻度变化A样品1.7—3.5mL1.8mlB空白2.0—4.1mL2.1ml硫代硫酸钠滴定液浓度0.01mol/L碘滴定液浓度0.05mol/L②计算：E=(B－A)×M×F×D×100=（2.1-1.8）×0.01×742×100×100=22260单位／(ml.小时)2.1.3紫外诱变结果图4:第二次照射五分钟平板第一次做的诱变育种没有长出菌落，因此重复了上述的诱导步骤，培养48h后仅长出5min平板其余均未长菌。2.2.4镜检结果图5:镜检结果图片经过镜检，我们发现其菌株确实为我们所需要的球杆状。2.2讨论2.2.1本次实验过程结果与结果总体分析此次实验整个过程中除紫外诱变，其他的都还比较顺利。实验过程中尝试很多菌株的诱变方法，平板筛选不成功后及时改进方案改为试管液体培养基梯度培养，我们最终得到了耐10000μ青霉素的菌株。经过镜检发现该菌株确实是球形杆菌，对此菌株进行了保存。在酶活力测定过程中，按药典配制的滴定液浓度经滴定测定不准确，原因是药品已过期导致其有效成分的损失或者没有及时将硫代硫酸钠避光保存，因而最终结果酶活力偏小。第一次紫外诱变后所有平板包括对照均没有长菌，对菌株进行了第二次10000单位诱导发现其确实为所需要的菌株，于是进行了第二次诱导。第二次诱导12h未长菌，48h后有些平板长了霉菌影响观测，仅能看到紫外照射五分钟平板长菌，但无法确定是否为所需菌株。实验中还出现了许多小问题，但都经过查资料或者向老师询问解决。每个组员在实验过程中都很认真。经过此次实验，从方案到过程完全由自己设计，学到的知识比之前一个学期实验所学到的还多，将思考能力和操作能力极好地结合了起来。2.2.2青霉素酶活力测定的影响因素经过初步分析，影响因素有以下几点：①原培养基中残留的青霉素噻唑酸对滴定过程和结果有一定的影响，针对此问题可以通过稀释100到1000倍来降低其影响。②实验过程中的“在暗处放置15min”很重要，不可省略，此处是碘与水浴中青霉素溶液与青霉素酶溶液反应产的青霉素噻唑酸反应过程，同时与空白组对照使结果更加准确。我们的结果不准可能也与时间未达到要求有关。③药品配制后要及时避光保存以免分解。经过查阅资料，我们发现：若离心后的发酵液上清能经过膜过滤处理，其结果将会更准确。如以下流程：发酵液→离心→上清液→调节ph→常规抽滤→滤液→0.45μm膜过滤，具体的需通过调节pH值,使絮凝剂与菌体及菌体内含释放物结合，形成絮状物，提高了过滤速率，同时又减少了菌体内含释放物对滴定的结果的影响。致谢非常感谢实验过程中老师的支持和帮助，使我们的实验能够正常完成，并且已基本达到预期效果。同时感谢本组成员的积极参与支持！