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1四川农业大学本科课程教学大纲一、课程名称：生物化学实验总学时：36学时二、课程的性质、地位和和任务生物化学是一门实践性很强的课程，按照我校“大基础教育，宽口径培养，按需要选择，主辅修结合，强能力训练，重素质培养”的本专科人才培养总体思路，生物化学实验从理论教学中剥离出来，单独行课，单独考核。按照四川农业大学1998年公布的本科教学计划，原基础生物化学、动物生物化学、食品生物化学合并为一门课——生物化学及分子生物学基础。其中的实验部分单列为一门课，名称为基础生物化学实验，36学时，1学分。本课程的任务是教授生物化学实验技术的基础理论及应用，并通过具体的实验教学使学生掌握常用的生物化学实验技术理论和方法，并能进行独立的实验操作，从而促进学生从事科学研究和技术工作的基本素质的提高和创新意识的培养。据此，我们对原三门实验教学大纲进行综合修改。新大纲由两部分组成，一部分系统介绍常用生物化学实验技术的基本原理和应用；第二部为具体的生物化学实验。在原已开设实验的基础上，新增添了部分生物化学大实验和一些综合性实验等新内容。将动物、植物、食品生化实验内容综合，实验材料可根据不同的专业而选定，由此建立生物化学实验技术的完整体系，拓宽学生的知识面。本门实验课最初以自编的《基础生物化学实验原理和方法》为教材，该教材根据我校的专业特色选取的实验，经过多年不断完善，收到了很好的使用效果。在此基础上，为适应专业和教学内容的调整，我校杨婉身教授主编了全国高等农业院校教材《现代生物化学实验技术》，其中收录了许多我校自编实验课教材的实验内容。该书的使用，不仅增加了本课程开设实验的选择面，也进一步提高了实验的总体质量。经过近几年的实施和改进，证实这种基础加综合性实践教学课程的设置，不仅加深了各个专业学生对生物化学的基本概念和基本技术的理解和掌握，使学生的理论学习和实践过程有机结合，同时，也为学生提供了参与综合性实验和创新性实验的机会，提高了学生的实践能力和思考能力，为其专业课的学习打下了扎实的基础。三、课程教学目标与基本要求第一部分：生物化学实验技术简介4学时第二部分：基本实验操作23学时第三部分：综合性、设计型实验9学时四、实验纲要第一部分生物化学实验技术简介(4学时)一、生化实验样本的制备1、动物样本的制备2、植物材料的处理3、微生物材料的处理二、分光光度法1、分光光度法2、分光光度法在生物化学中的应用3、常用分光光度计：721型、752型紫外分光光度计的使用2三、层析法1、层析法的原理及应用2、常用的几种层析方法及原理：（1）纸层析；（2）薄面层析；（3）凝胶层析；（4）亲和层析四、电泳法1、电泳的基本原理及应用2、常见的几种电泳方法（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳（2）琼脂糖凝胶电泳（3）醋酸纤维薄膜电泳（4）毛细管电泳3、影响电泳的主要因素五、离心分离技术1、离心分离技术的原理和应用2、常用离心机的使用六、生物大分子的分离纯化的一般原理和步骤第二部分生物化学基础实验实验一蛋白质的两性解离及等电点的测定（2学时）目的和要求：认识蛋白质的两性解离性质，了解等电点的意义及其与蛋白质分子沉降的关系，学习蛋白质等电点测定方法。实验内容：氨基酸通过肽键连接成多肽链，除N-端和C-端外，还有一定数量的可解离的侧链基团，因此蛋白质也是两性电解质。蛋白质分子上可解离基因的解离程度与溶液的pH值有关。在一定pH条件下，就会解离而带电，带电的性质和多少决定于蛋白质分子的结构及溶液的pH。在某一pH条件下，蛋白质分子所带的正电荷数恰好等于负电荷数，即净电荷等于零。此时蛋白质质点在电场中不移动，溶液的这一pH值称为该蛋白质的等电点（pI）。如果溶液的pHpI，则蛋白质分子结合一部分H+，而带正电荷在电场中就向负极移动。反之，溶液的pHpI，则蛋白质分子会解离一部分H+而带负电荷，此时蛋白质分子在电场中就会向正极移动。COOHCOO-COO-+H+-H+PrPrPr-H++H+NH3+NH3+NH2阳离子两性离子阴离子pHpIpH=pIpHpI在电场中：带正电，向负极移动不移动带负电，向正极移动由于各种蛋白质解离基团的种类和数量不同，因此等电点也不相同。蛋白质在等电点时净电荷为零，溶解度最低，易发生聚沉。配制不同pH的缓冲溶液，通过观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况，即可大致确定其等电点。3实验二可溶性蛋白质含量的测定—双缩脲法（3学时）目的和要求：掌握测定可溶性蛋白质含量常规测定的原理和操作方法，熟悉分光光度计的使用。实验内容：本实验介绍双缩脲法测定可溶性蛋白质的含量。双缩脲(H2NOC-NH-CONH2)可由两分子尿素加热至180℃左右生成，它在碱性条件下能与Cu2+结合生成紫红色络合物（称双缩脲反应）。而蛋白质分子中含有两个以上相邻的肽键，其结构与双缩脲类似，因此也能发生双缩脲反应，生成紫红色络合物，其反应后溶液颜色的深浅与蛋白质（浓度）含量在一定范围内呈线性关系，符合比尔定律，而且与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关，受蛋白质特异性影响较小，故可利用此反应通过比色法测定蛋白质的含量，该法测定蛋白质浓度范围为1-10g/L。实验三薄层层析法分离鉴定植物组织中游离氨基酸（3学时供选作）目的和要求：了解层析技术的一般原理，分类及应用范围。重点掌握薄层层析法的原理及操作技术，用以分离鉴定植物组织中游离氨基酸组分。实验内容：本实验以硅胶G制成薄板来分离鉴定植物组织中的游离氨基酸组分。硅胶G加有10—15%的煅石膏粉作为粘合剂，是微酸性的吸附剂，以它作为固定相，选择适当的溶剂作流动相，由于各种氨基酸的极性不同，被硅胶G吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，点在硅胶G薄板上的混合氨基酸被不同程度地吸附，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。一般来说，酸性氨基酸和中性氨基酸受吸附力较弱，移动距离较长；碱性氨基酸所受吸附力较强，移动距离较短。经过一段时间，即可将混合物中各组分分离开。展层后用茚三酮溶液显色，将样品各显色斑点的Rf值与同时展层的标准氨基酸的Rf值比较，即可判断样品中含有何种氨基酸。实验四血清蛋白质醋酸纤维薄膜电泳（3学时）目的和要求：了解电泳技术的原理、分类和应用范围，重点掌握醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质的原理和基本技术。实验内容：醋酸纤维薄膜电泳是以醋酸纤维薄膜作为支持物的一种电泳方法。醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120μm，渗透性强，对分子移动阻力小。本实验将其用于分离血清蛋白质。蛋白质分子是两性电解质，在pH小于其等电点的溶液中，蛋白质分子结合一部分H+而带正电，在电场中向负极移动，在pH大于其等电点的溶液中，蛋白质分子解离出H+而带负电，在电场中向正极移动。血清中含有各种蛋白质，将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的醋酸纤维薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质的等电点都小于7.5在此缓冲液中带负电荷，在电场中移向正极，血清中不同蛋白质由于带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同，带电荷多及分子量小者泳动速度快，带电荷少及分子量大者泳动速度慢。经过一定的时间后，取消电场，将薄膜取出，立即将其浸入氨基黑10B染色液中，使蛋白质固定并染色。随后将薄膜移入漂洗液中，洗至背景无色为止。此时薄膜显示出蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，各区带分别为清蛋白，α1，α2，β和γ-球蛋白。实验五聚丙烯酰胺凝胶电泳分离预染血清脂蛋白（5学时）目的和要求：学习了解盘状聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作与原理，掌握用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、鉴定蛋白质的技术。4实验内容：聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamidegelelevtrophoreis,缩写PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作支持物的一种区带电泳，常用于生物高分子物质的分离鉴定。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）和交联剂N’N-甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合而成，具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物在垂直的玻璃管中进行电泳。本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定血清中的脂蛋白。脂蛋白是一类结合蛋白质，血清脂蛋白包括α-脂蛋白、β-脂蛋白、前β-脂蛋白、乳糜微粒等组分。将预先用苏丹黑染色的血清样品加入凝胶管中电泳后即可直接观察到上述各组分的显色区带，若用光密度扫描仪则可定量测定。实验六酶促转氨反应（4学时）目的和要求：利用纸层析方法定性测定植物（动物）组织中转氨酶的活性，掌握分配层析的原理以及层析法研究代谢的基本方法。实验内容：本实验以谷氨酸和丙酮酸混合溶液在GPT作用下的反应来观察酶促转氨基作用，其反应式为：丙氨酸α-酮戊二酸丙酮酸谷氨酸反应结果可利用纸层析分离分析鉴定。实验七影响酶作用的因素（3学时）目的和要求：了解pH。温度、抑制和激活剂以及酶浓度对酶的影响，加深对酶的基本性质和特点的认识和理解。实验内容：本实验借淀粉酶对淀粉的水解作用来观察，温度、pH值、激活剂等对酶促反应的影响，根据淀粉及其水解产物与碘呈色的不同，指示淀粉的水解程度，作为酶活性大小的指标。脲酶大量存在于植物组织中，能专一性催化尿素分解。若体系存在NaH2PO4则反应如下：OH2OH2ONaH2PO4C————→CO2+2NH3———→（NH4）2CO3———→NaHCO3+(NH4)2HPO4脲酶NH2NH2在底物尿素足量时，酶浓度越大，溶液pH升高越快，这可用酚红指示剂（pK=7.81，pH颜色范围6.8—8.4，黄—红）指示。指示剂变成标准管溶液（pH特定）的颜色所需时间t（秒）越短，1/t可以表示反应速度大小，本实验用目视比色法就可明显地观察到酶浓度与酶促反应速度约成正比例关系。5实验八过氧化氢酶活力测定（3学时）目的和要求：掌握酶活力测定的方法，加深对酶促反应速度及活力单位的理解实验内容：过氧化氢酶能把过氧化氢分解成水和氧，其活力大小以一定时间内一定量的酶所分解的过氧化氢量来表示。被分解的过氧化氢量可用碘量法间接测定。当酶促反应进行一定时间后，终止反应，然后以钼酸铵作催化剂，使未被分解的过氧化氢与碘化钾反应放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘。其反应为：过氧化氢酶2H2O2—————→2H2O+O2钼酸铵H2O2+2KI+H2SO4————→I2+K2SO4+2H2OI2+2Na2S2O3————→2NaI+Na2S4O6反应完后，以样品溶液和空白溶液的滴定值之差求出被酶分解的过氧化氢量，即可计算出酶的活力。五、综合性实验的开设（2选1）实验项目名称：SOD的分离纯化、活力测定及同工酶分析学时：9学时1、实验目的：熟悉从生物样品中提取与纯化酶的一般方法。掌握超氧化物歧化酶活性测定的原理和方法。掌握超氧化物歧化酶同工酶活性染色及鉴定2、实验内容及课时安排(1)、SOD的分离纯化：3学时(2)、SOD活力测定：3学时(3)、SOD同工酶分析：3学时3、实验材料、试剂和器材（1）SOD的提取①ACD抗凝剂：柠檬酸10g，柠檬酸钠30g，葡萄糖25g，用适量蒸馏水溶解并稀释至1000ml.②0.9%NaCl：称取NaCl0.9g，溶于100ml蒸馏水中。③丙酮④95%乙醇⑤氯仿（2）考马斯亮蓝G-250法测蛋白质①考马斯亮蓝G-250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%（W/V）的磷酸，蒸馏水定容至1000ml。此试剂常温下可保存30天。②标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清白蛋白25mg，加蒸馏水溶解并定容至100ml。吸取上述溶液40ml，用蒸馏水稀释至100ml，即为100ug/ml的标准蛋白质溶液。（3）SOD活力测定①50mmol/LpH8.3磷酸缓冲液②10mmol/LEDTA钠盐溶液③3mmol/L邻苯三酚溶液（用10mmol/L盐酸配制）6（4）SOD同工酶活性染色实验器材：紫外分光光度计分析天平离心机（4,000rpm）高速台式离心机（10,000rpm）电动搅拌机电泳仪一