亲和色谱的分离技术

亲和色谱的分离技术摘要本文主要对亲和色谱的相关信息如起源发展、分类、应用、前景等做了介绍。重点介绍了亲和色谱的分类以及不同的亲和色谱的原理特点以及应用。关键词亲和色谱起源发展；亲和色谱分类；亲和色谱应用；亲和色谱前景前言亲和色谱在就是把与目的产物具有特特异亲和力的生物分子固定化后作为固定相，可把目的产物从混合物中分离出来。如抗原与抗体，酶蛋白与辅酶。如今，很多研究学者研究不同类型的亲和色谱。冯文科等［1］介绍了三嗪染料配基亲和色谱(包括高效亲和色谱)分离纯化蛋白质的基本原理和方法，并介绍了染料亲和色谱固定相制备方法及应用的最新发展；赵胜利等［2］介绍了固定金属离子亲和色谱(IMAC)吸附蛋白质的基本原理、蛋白质吸附与解吸的影响因素以及洗脱过程中需要注意的问题，并简述了IMAC今后研究的方向；孙维敏［等3］研究抗体纯化中亲和色谱配体的进展；庄海宁［4］研究免疫亲和色谱的原理及其在食品安全检测中的应用；王迪等［5］研究免疫亲和色谱及其在兽药残留检测中的应用；王继华等［6］阐述了免疫亲和色谱技术生化提纯可溶性核糖核蛋白SSA抗原、SSB抗原的特点，同时展望了免疫亲和色谱的发展状况；贾凌云等［8］研究亲和色谱仿生配基在筛选和设计方面的进展；苏成芝等［10］制备了TrypsinSepharose4B亲和层析柱，采用硫酸铵、三氯醋酸沉淀、离心色谱、降冻干燥等技术，对猪胰脏中胰蛋白酶抑制剂进行分离纯化，测定各步中的活性；钱俊青［11］等应用前沿亲和色谱研究分子间相互作用及其应用。本文主要介绍亲和色谱的发展、原理、分类以及各种亲和色谱的特点以及应用，还有其前景发展。1、亲和色谱的起源和发展1910年Starkenstein将蔗糖酶抗体吸附到高岭土上研究了抗体和抗原的相互作用并发现淀粉酶与不溶解淀粉键合得十分紧密；1924年Engelhardt提出固定配偶原理作为分离生物活性物质的方法；1933年Holmtergh利用淀粉凝胶进行色谱分离从淀粉酶中分离出淀粉酶；1951年Camptell将抗原白蛋白固定在重氮基对氨基苄基纤维上用以纯化抗体；1953年Lerman将偶氮染料固定在纤维素上纯化蘑菇中的络氨酸酶；1954年GrubhoferSchleith为应用目的将羧肽酶淀粉酶胃蛋白酶核糖核酸酶固定在重氮化氨基聚苯乙酰树脂上；1959年Porath和Flodin将葡萄糖Sephadex基体引入亲和色谱中使亲和色谱得到快速发展；1963年Merrifield提出固相肽合成方法为亲和色谱固定相制备提供了可借鉴的途径；1964年Hjerten研制出球形琼脂糖它与葡聚糖都适用作亲和色谱的基体材质；1967年AxenPorthErnback提出用溴化氰活化琼脂糖的方法为多肽蛋白质在基体上固定化开辟了新的方法；1968年Cuatrecases和Wilchek定义亲和色谱的概念扩展亲和配位体范围包括酶抗原半抗原抗体激素维生素外援凝集素糖蛋白膜蛋白病毒细胞等确立了生物特效亲和色谱方法；1970年Cuatrecasces进一步完善溴化氰活化琼脂糖的方法并提出在固相基体和配位体之间插入空间间隔壁的概念和方法成功的解决了配位体的立体可接受性问题对亲和色谱的发展做出了突破贡献；1972年Yon提出利用在水溶液中非极性官能团之间的接触组合来分离蛋白质和核酸的硫水作用色谱方法Wulff提出了印迹分子色谱法；1973年Couper提供甲基丙烯酸乙二醇聚酯载体SpheronBrocklehurst提出用2吡啶二硫化物作配位体的共价色谱法Hayman用亲和色谱法分离细胞；1974年Epton提供聚丙烯酰吗啉载体EnzacrylEasterday提出用三苯甲烷染料作配位体的染料配位色谱方法；1975年Kristeinsen用亲和色谱法分离病毒；1977年Porath提出用24二硝基苯作配位体的电荷转移色谱方法；1978年Porath提出用金属离子螯合物作配位体的定位金属离子亲和色谱方法Ohlson提出以大孔微粒硅胶作载体的高效液相亲和色谱法；1980年到1990年CD冠醚穴醚杯芳烃大环抗生素用作亲和包合配位体发展包含了配合物亲和色谱方法Armstrong首先应用包合配合物亲和色谱方法；1990年到2000年新型载体获广泛应用如灌注色谱固定相Poros无极氧化物ZrO2TiO2CeO2WO3及杂化材料ZrO2脲醛树脂复合微球；如今，亲和色谱已经广泛应用于生物分子的分离和纯化，是目前分离纯化药物蛋白等生物大分子最重要的方法之一，如结合蛋白、酶、抑制剂、抗原、抗体、激素、激素素受体、糖蛋白、核酸及多糖类等；也可以用于分离细胞、细胞器、病毒等。通过人们不懈的研究，利用亲和层析技术已成功地分离了单克隆抗体、人生长因子、细胞分裂素、激素、血液凝固因子、纤维蛋白溶酶、促红细胞生长素等产品。该技术的最大优点在于：利用它可以从粗提物中经过一些简单的处理便可得到所需的高纯度活性物质，它有效地集合了化工与生物技术，是生物化工的重要发展方向。2、亲和色谱的原理以及基本过程2.1亲和色谱的原理亲和色谱也称为亲和层析，是色谱分离技术的重要分支，是一种利用固定相的结合特性来吸附目标产物，而达到分离纯化的液相色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连续与待分离的物质有一定结合能力的分子，涉及分子间的范德华力、疏水作用力、静电吸引力、络合作用以及空间位阻效应等作用力因素，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的集团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。例如利用酶与基质(或抑制剂)、抗原与抗体，激素与受体、外源凝集素与多糖类及核酸的碱基对等之间的专一的相互作用，使相互作用物质的一方与不溶性担体形成共价结合化合物，用来作为层析用固定相，将另一方从复杂的混合物中选择可逆地截获，达到纯化的目的。2.2亲和色谱的基本过程（1）配基固相化将与纯化对象有专一结合作用的物质连接在水不溶性载体上制成亲和吸附剂后装柱（2）亲和吸附将含有纯化对象的混合物通过亲和柱纯化对象吸附在柱上其他物质流出色谱柱（3）解吸附用某种缓冲液或溶液通过亲和柱把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来如果分离的目的是去除溶液中某种分子那么只要分子能与介质结合即可可以不必进行洗脱3、亲和色谱的分类按照分离原理可以分为免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱以及拟生物亲和色谱。3.1免疫亲和色谱（IAC）3.1.1IAC的原理免疫亲和色谱的应用出现在上世纪八十年代末，是一种将免疫反应和色谱分析方法相结合的分析方法。它是利用抗体与其相应抗原的作用具有高度的特异性和高度结合力的特点，用适当的方法将抗原或抗体结合到层析载体上，从而有效地分离和纯化各自互补的免疫物质。该法基于免疫反应的基本原理，利用色谱的差速迁移理论。首先，将抗体与惰性微珠共价结合，然后填入柱中，再将含有抗原的溶液过免疫亲和柱，抗原与固定的抗体结合，其它成分则直接沿柱流下，最后再用合适的洗脱剂将待测组分洗脱下来，而得到纯化的抗原。3.1.2IAC的特点（1）专属性：IAC是利用抗体一抗原的专属性反应实现分离纯化的，只有具有特征决定簇的分析物才能与IAC柱上固定的抗体发生特异性的结合，因此，制备高纯度的抗体(如单克隆抗体)以及具有多个活性位点的抗体可以提高结合抗原时的选择性；（2）高效能：其高效能首先体现在它能成百上千倍的提高样品的纯化率，还体现在可以缩短分析时间，提高分析效率，另外，IAC柱可以再生，大大提高了其利用效率。影响IAC效率的主要因素有：柱容量，基质的选择，基质的活化与抗体的偶联，抗原抗体结合能力及流动速率与柱压；（3）灵敏度高：生物样本分析中，样品浓度通常较低，故分析方法的高灵敏度是首先要考虑的。3.1.3IAC的应用现今，免疫亲和膜的应用主要在以下两个方面：1)抗体的分离纯化，免疫亲和膜主要应用于从多种免疫球蛋白的混合物中，如从免疫的动物血清中，提取某一特定的组分，此法快速简便，能获得特异性很强的抗体。目前，多种抗体采用硝酸纤维素(NC)膜进行分离纯化。2)快速诊断测试，将特异性的抗原(或抗体)以条带状固定于膜材料上，将胶体金标记试剂吸附在结合垫上。当待测样品(血清或尿液)加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解固化在结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原(或抗体)的区域时，待测物和金标记试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果，而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。此外，庄海宁等在食品检测、兽药残留检测以及核糖核酸蛋白等中发挥着不可替代的作用。3.2金属亲和色谱（IMAC）3.2.1IMAC的原理主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而实现分离蛋白质的目的。3.2.2IMAC的特点(1)配基稳定性高，不易脱落；(2)金属离子配基价格低廉，再生成本低；(3)可在高盐浓度下操作，从而省去了脱盐的预处理步骤，而且可以减少非特异性吸附；(4)蛋白质洗脱比较容易，采用较低pH或采用竞争性物质如咪唑、EDTA便可将吸附蛋白解吸下来。影响蛋白质与金属螯合柱作用的因素很多，主要有金属离子和蛋白质表面配体的性质、溶液pH、离子强度和其它竞争配体等。3.2.3IMAC的应用IMAC在生物大分子研究中的应用表现在两方面：蛋白质的识别和分离纯化。赵胜利等研究蛋白质在固定金属离子亲和色谱中吸附与洗脱的一些情况。3.3拟生物亲和色谱近几年发展起来的仿生亲和小分子配基新技术，其要旨为：对需要纯化的目标蛋白，在组合生物分子库和组合化学分子库中筛选其相应的亲和配基，然后将其固定到支持介质上，这种组合出来的亲和配基比天然生物分子性质更稳定，特异性及重复性更好。主要代表为染料配基亲和色谱和多肽亲和色谱。3.4分子对亲和色谱分子对亲和色谱是利用生物分子对之间专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的一种亲和层析方法。3.5共价亲和层析共价亲和层析是生物分子中的功能性集团与层析剂上配基形成可逆性的共价键的一种分离层析方法。可以用于纯化牛乳巯基氧化酶，从大肠杆菌培养液中纯化青霉素酰化酶等。3.6疏水层析疏水层析是生物分子中的功能性基团与层析剂上配基形成可逆性的疏水键结合的一种亲和层析方法。3.7凝集素亲和层析凝集素亲和层析是利用生物分子中的功能性基团与层析剂上的凝集素配基形成可逆性亲和结合的一种亲和层析方法。4、亲和色谱的应用不管哪种亲和色谱的方法，在蛋白质纯化和蛋白质的识别、兽药残留检测、食品安全检测、固定金属、抗体等方面都起着重要作用。5、亲和色谱前景亲和色谱技术发展至今已具备了比较完整的体系，它以其高选择性和可逆性开创了生化分离的新纪元，并在这一领域独领风骚。但不可否认的是，该项技术并非尽善尽美，必须一步一步去的完善。，膜亲和色谱正以更快的速度在发展。有人称：“膜的表面改性技术领导膜进入了9O年代”；“未来的lO年将是产生新的更为先进的第三、第四代膜的时代”。这里所指的第三、第四代膜就是包括亲和膜在内的各神化学改性膜。无疑和国外一样，膜亲和色谱技术今后也将在我国获得进一步的发展，得到更广泛的应用，产生更大的经济和社会效益，逐渐成为一种新的生物大分子纯化分离的重要手段。讨论亲和膜分离的操作过程，开始阶段一般都是手动、分步操作从平衡、上样到洗涤洗脱、清洗要数十分钟到数小时。近些年来，随着微处理机的使用，整个分离过程可在微处理机控制下，实现全盘自动化操作。一次循环的分离时间有些可缩短到几分钟内完成无论是输减泵，切换阀、膜分离器，还是检测器、馏分收集器等的性能都有了很大改进膜分离器形状已由最初单一的板式发展成板式、卷式、中空纤维多种形式，体积也越来越小。中空纤维式由于有很高的样品负荷容量，又可在