人体解剖及动物生理学实验报告神经干复合动作电位

人体解剖及动物生理学实验报告神经干复合动作电位【实验题目】神经复合动作电位1、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）阈值和最大幅度的测定2、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）传导速度的测定3、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）不应期的测定【实验目的】确定蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）的1、临界值和最大值2、传导速度3、不应期（包括绝对不应期和相对不应期）【实验原理】神经系统对维持机体稳态起着重要作用，动作电位（AP）是神经系统进行通信联系所采用的信号。多个神经元的轴突集结成束形成神经，APs沿感觉神经经外周传向中枢或沿运动神经由中枢传向外周。坐骨神经干由上百根感觉神经和运动神经组成，分别联系腿部的感受器和效应器（骨骼肌）。如果电刺激一根离体的坐骨神经干，通过细胞外引导方式，就能记录到神经干复合动作电位（CAP）。一个CAP是一系列具有不同兴奋性的神经纤维产生的多个AP的总和。刺激强度越大，兴奋的神经纤维数目就越多，CAP的幅度也就越大。与胞内引导得到的单细胞AP相比，CAP是双相电位，逐级递增（非全或无），并且幅度较小。阈电位是指一个刚刚能观测到的CAP，所对应的刺激为阈刺激。在一定范围内增加刺激强度，CAP幅度相应增大。最大CAP所对应的最小刺激电位即最大刺激。动作电位可以沿神经以一定的速度不衰减地传导，传导速度的快慢基于多种因素，这些因素决定了生物体对其坏境的适应性。它们包括神经的直径、有无髓鞘、温度等等。神经在一次兴奋过程中，其兴奋性将发生一个周期性的变化，最终恢复正常。兴奋的周期性变化，依次包括绝对不应期、相对不应期等等。绝对不应期内，无论多么强大的刺激都不能引起神经再一次兴奋；相对不应期内，神经兴奋性较低，较大的刺激能够引起兴奋。绝对不应期决定了神经发放冲动（动作电位）的最高频率，保证了动作电位不能叠加（区别于局部电位），以及单向传导（只能有受刺激部位向远端传导，不能返回）的特性。不应期的产生依赖于细胞膜上特定离子通道的特点，如钠、钾离子通道。【实验方法】1、制作蟾蜍坐骨神经干标本（1）双毁髓处死蟾蜍后，剥去皮肤，暴露腰骶丛神经，游离大腿肌肉之间的坐骨神经干及其下行到小腿的两个分支：胫神经和腓神经，三段结扎，剪去无关分支后离体。注意保持神经湿润。（2）将神经搭于标本盒内，保证神经与电极充分接触，中枢端接触刺激电极S1和S2，外周端接触记录电极R1-R5，之间接触接地电极。（3）刺激输出线两夹子分别连接标本盒的刺激电极S1和S2，插头接生物信号采集系统RM6240的刺激输出插口；信号输入倒显得红色和绿色夹子分别连接记录电极（绿色夹子在前，引导出正向波形，即出现的第一个波峰向上），黑色夹子连接接地电极，插头接通道A、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）临界和最大幅度的确定（1）打开信号采集软件，从“实验”菜单中选取“神经干动作电位”，出现自动设置的界面，各项参数已设置好，界面中只有一个采集通道，对应仪器面板上的通道1（因此信号输入线应连接在通道1）。（2）检查装置链接正确，确定装置是否正常工作，以及神经是否具有活性。采用刺激强度1V，刺激时程0.2ms，延时5ms，刺激模式为单刺激。选择“同步触发”，按下“开始刺激”后，正常情况下屏幕上会出现一个双相电位即CAP。（3）降低刺激强度，确定CAP的阈电位。记录刺激阈值及CAP幅度（波峰与波谷之间的差值）。（4）以0.05V或更小的间隔，逐渐增大刺激强度，观察CAP幅度的变化，同时，记录刺激电位及对应的CAP幅度，直到CAP达到稳定，即最大值（神经标本在正常生理活性时，1V以内的刺激强度即可引起最大的CAP）。B、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）传导速度的确定（1）从“实验”菜单中选取“动作电位传导速度”，界面出现两个采集通道，对应通道1和通道2，因此采用两对引导电极R1-R2和R3-R4（或R2-R3），同时输入两道信号。（2）使用单刺激模式，调整刺激强度，使产生最大CAP。（3）测量两个通道显示的动作电位起点的时间差。（4）测量R1和R2之间神经的长度。（5）重复步骤1-4至少三次。（6）计算传导速度：传导速度=△D（mm）/△T（ms）（7）计算几次重复测量得到的传导速度的平均值（Mean）和标准差（SD）。C、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）不应期的确定（1）采用双刺激模式，刺激条件相同，产生一对幅度相同的最大的CAP。（2）逐渐减小两刺激间隔，直到第二个CAP幅度刚刚开始减小，即进入相对不应期。此波间隔与绝对不应期之差即为相对不应期。（3）继续减小间隔，直到第二个CAP刚刚完全消失，此间隔即为绝对不应期。（4）重复步骤1-3至少三次。（5）计算绝对不应期和相对不应期的均值（Mean）及标准差（SD）。【实验结果】A、蟾蜍坐骨神经干CAP阈值和最大幅度的确定表1.蟾蜍坐骨神经干CAP随刺激强度的变化数据实验次数刺激强度（V）CAP（mV）实验次数刺激强度（V）CAP（mV）10.912.08070.492.03020.842.07080.421.84230.772.04090.351.72040.702.280100.281.20050.632.080110.210.57060.562.013120.140.000图1.蟾蜍坐骨神经干CAP的阈电位（当前刺激强度为0.16V）图2.蟾蜍坐骨神经干CAP的最大幅度2.28mV（当前刺激强度为0.70V）图3蟾蜍坐骨神经干CAP随刺激强度的变化曲线图由实验数据可得,当刺激强度为0.16V时，刚好能观察到一个CAP;逐渐增加刺激强度，当刺激强度增加到0.70V时，动作电位的幅度不再增加，即最大刺激强度为0.70V，此时CAP为2.280mV。由图像可得出，存在一个CAP开始出现的刺激强度临界值即阈值，在一定范围内，随着刺激强度的逐渐增强，CAP也在逐渐增加，当刺激强度达到一个最大值时，在增加刺激强度，CAP的值保持不变。B、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）传导速度的测定图4.某次神经干兴奋传导速度的测定图表2.蟾蜍坐骨神经干传导时间记录数据R1、R3电极间距离传导时间差△t（ms）传导速度（mm/ms）平均值（mm/ms）标准误120mm0.9521.0524.3351.935220mm0.9521.05320mm0.7526.67420mm0.728.57由上表数据可得传导速度的平均值为24.335mm/ms，标准差为3.87，标准误为1.935。由标准差和标准误的数据可以看出，四次实验测得的传导速度波动性不大，即实验数据较为准确。C、蟾蜍坐骨神经干复合动作电位（CAP）不应期的测定图5.双刺激下刚刚进入相对不应期内的神经干CAP图图6.蟾蜍坐骨神经干CAP的绝对不应期测量图表3.蟾蜍坐骨神经干相对不应期和绝对不应期的测量数据相对不应期（ms）绝对不应期（ms）第一次实验8.11.1第二次实验7.20.5第三次实验4.80.5均值6.70.7标准误1.590.20对坐骨神经干进行双刺激，会出现两个CAP。减小两个刺激之间的间隔，直到第二个CAP开始减小，表明第二个刺激进入了前一次兴奋的相对不应期；继续减小刺激间隔，直到第二个CAP刚好完全消失，表明第二个刺激落入第一次兴奋后的绝对不应期；由上表数据可得，蟾蜍坐骨神经干CAP的绝对不应期为0.7ms，相对不应期为6.7ms。由上表可得绝对不应期测量的标准误较小，为0.2，表明数据的波动性较小，结果较为准确；而相对不应期的测量中标准误相对较大，为1.59，表明数据的波动性较大；分析原因可能是实验时间过久，未及时将神经浸泡到任氏液中导致神经失活或者实验刺激强度过大，间隔过短，连续刺激使得神经灵敏性降低。【分析讨论】1、对比动作电位，分析神经干复合动作电位（CAP）的特点，并解释其随刺激幅度变化而变化的现象。答：一个CAP是一系列具有不同兴奋性的神经纤维产生的多个AP的总和。CAP是双相电位，逐级递增（非全或无），并且幅度较小。神经干是混合纤维，包含着多种兴奋性不同的神经；坐骨神经是由上百根感觉神经和运动神经组成的，电刺激离体的坐骨神经，就能记录到神经干复合电位，且刺激的强度越大，兴奋的神经越多，CAP的值也就越大，即阈值强度的刺激刚刚可以引起神经干中一些兴奋性较高的纤维产生动作电位，随着刺激强度的增加，其余兴奋性较低的纤维陆续产生动作电位，故在一定范围内CAP的值会随刺激幅度的增加而增加；当刺激超过最大强度时，全部神经纤维都产生了动作电位，再增加刺激强，CAP的值保持不变。2、分析解释测量神经传导速度的实验中通道2和1所记录的CAP的不同之处，分析蟾蜍坐骨神经干中所包含的神经纤维种类及其传导速度，判断所测定的纤维类型，分析实验中可能影响传导速度数值的因素。答：（1）实验中采用两对引导电极同时输入两道信号，通道1记录的是第一对引导电极引导出的CAP图像；通道2记录的是第二对引导电极引导出的CAP图形。由实验结果可以看出，通道1所记录的CAP值较通道2所记录的CAP值大，分析原因可能是通道1电极更靠近神经的中枢端，中枢端神经较粗和多，兴奋性比通道2电极记录的更强。（2）神经纤维的传导速度与神经纤维的种类，神经纤维的粗细程度等有关，不同类型的神经纤维传导速度不同，其传导速度主要受神经纤维的直径、内阻及有无髓鞘的影响。由相关资料可得，蟾蜍坐骨神经干为混合型神经，其直径一般为3-29μm，其中直径最粗的有髓纤维为Aα类纤维，它是蛙神经的主要组成部分，传导速度在正常室温下为35-40m/s。蟾蜍的坐骨神经是混合神经，由实验测得神经纤维的传导速度是24.335m/s，可知其神经纤维主要类型是A类神经纤维。（3）实验温度、神经的完整程度、神经的活性、蟾蜍个体差异、仪器的测量误差等都会影响神经传导速度的测量值。3、分析不应期之内CAP变化的原因。答：由实验可得，在绝对不应期内，无论给予第二次刺激强度多大，都不会产生第二个动作电位，因为动作电位的产生依靠钠离子的内流，电压门控的Na+通道在激活后会处于失活状态，然后再恢复到关闭状态，等待重新开放，进一步引发新动作电位的产生；而绝对不应期内电压门控的Na+通道处于全部开放或失活的状态，无论再给予多强的刺激，这些门控通道都不能产生钠离子的内流，即无法引发第二个动作电位。在绝对不应期之后，膜的兴奋性逐渐上升，但仍低于原水平，部分Na+通道重新恢复到静息状态，这些Na+通道能够在新的刺激下重新开放引发动作电位，因此在相对不应期内给予一个大于正常阈强度的刺激，能再次使其产生动作电位。但是由于通道活性未达到正常水平，所以第二个动作电位幅度小于正常值。4、分析电生理实验中细胞外记录和细胞内记录在方法学、所获信号以及应用方面的不同之处。答：细胞外记录是在不损伤相关记录的神经元的前提下进行的，一般是放在细胞或组织表面即可进行记录，此时记录到的神经元的活动较细胞内记录更接近于生理状态；细胞外记录得到的信号是是双相波峰（正—负）；细胞外微电极记录一般用来测量细胞放电的准确数目，而用来测量提供单个细胞放电大小。在整体动物实验时，可以通过细胞外记录确定被记录的神经元的属性或类别。细胞内记录是用尖端直径小于50μm的微细电极直接穿破细胞膜后的记录，可获得细胞膜在静息状态与兴奋状态时的有关膜电位变化的数据，可以观察单个神经元的动作电位、膜电位变化及突触后反应；但在记录过程中，电极穿刺对细胞的损伤较大，记录的稳定性较差。该方法主要还是侧重对整体动物的研究，而对离子通道的功能和药理作用及离子通道的调控机制等方面，目前还不能通过载体细胞内技术实现，只能通过膜片钳技术来实现。5、分析实验中应注意的问题（1）剥离神经要小心仔细，神经干尽可能长并保证神经的完整性，但要去除多余的神经以免实验测量时干扰限号；（2）用棉线结扎神经时，棉线不要留的太长，以免干扰信号；（3）将神经干放在引导电极上时，不能与标本盒壁接触，尽量拉成水平线，不能折叠或倾斜防止；（4）刺激强度在开始时不能过强，应逐渐增强或减弱，以免过强的刺激使神经标本损坏；（5）进行神经传导速度的测量实