优势醋酸菌的分离筛选

优势醋酸菌的分离筛选焦文娟王花秀李鲜鲜彭浩然焦晓阳周口师院07生物工程（2）班摘要:利用液醋分离筛选出2株较优醋酸菌,同时对这2株醋酸菌的产酸速度、耐酒度、耐温度、耐食盐能力、酒精转化率等性能及果汁发酵产生果醋进行了研究。结果表明:2株醋酸菌产酸速度均较快,最适发酵温度均为30℃左右;酒精转化率醋酸菌28号为89.0%,醋酸菌36号为92.8%,醋酸菌36号要比醋酸菌28号更耐高浓度酒精;用醋酸菌36号纯种进行果汁发酵产生果醋,其总酸为42.7g/L。关键词醋酸菌;果醋;耐酸度;耐温度（-）研究的意义及现在的进展：果醋作为一种酸性发酵健身饮料,含有丰富的维生素、无机盐、氨基酸和有机酸类,且风味独特,因而深受广大消费者欢迎。在果醋生产中,醋酸菌的性能对产品质量、发酵效率有很大影响。所以,选育产酸快、耐酒度、耐高温、耐食盐、酒精转化率高、适合果醋生产的醋酸菌是一项十分重要的工作。此外，因醋酸菌的活动将乙醇氧化为乙酸，即醋酸，可用于食品酿造中。食醋的酿造大体上可分为表面发酵法和深层发酵法仁忍。这两种发酵方法主要都是依靠醋酸菌的活动将乙醇氧化为乙酸即醋酸。国外对醋酸菌优质菌株的选育和醋酸发酵机理的研究非常重视,做了大量工作。国内对醋酸菌优良菌种的应用也日益重视起来,并积累了不少有关醋酸菌分类鉴定及性能研究的资料。目前我国应用于液体醋生产的醋酸菌有工恶臭醋酸杆菌混浊变种普遍应用于酿醋生产。最适培养温度28到30度。最适pH值3.5到6.0耐乙醇能力小于0.08,最高产酸量70到90g/l。能进一步将醋酸氧化为二氧化碳和水过氧化反应。沪酿1.01:罗旺醋酸杆菌,是上海醋厂从丹东速酿醋中分离到的一株优良醋酸菌,也是我国酿醋行业普遍使用的菌种。沪酿1.079:是1984年从上海醋厂老法发酵醋酷中分离到的一个新菌株。在0.1乙醇时产酸达到63.6g/l,而且耐乙醇能力达到0.17乙醇时仍能产酸。（二）材料与方法1实验材料液醋:由大连调味食品厂提供;浓缩苹果汁:由大连真爱果汁公司提供。葡萄酒酵母:由大连轻工业学院微生物教研室提供。2实验方法培养基的制作、酸度测定、醋酸定性试验.一基础培养基1%酵母膏,1%葡萄糖。pH4.5,50000Pa灭菌30min。使用前加入0.03无水乙醇。二产酸试验培养基1’基础培养基临用前加入0.07无水乙醇,分装于500ml三角瓶,每瓶50ml;2’酵母膏1%,pH4.5使用前按需要量加入无水乙醇,分装于500ml三角瓶,每瓶70ml。以上培养基用冰乙酸调pH值。三分离和斜面保藏培养基100ml基础培养基中加入2%琼脂,灭菌后加入5%无菌碳酸钙和0.03无水乙醇,为分离培养基。分装试管,灭菌后摆成斜面即为保藏培养（三）研究方案1醋酸菌筛选液醋→增殖培养→稀释分离→选取单菌落→试管斜面培养→液体试管培养→液体三角瓶培养→测酸→确定菌株→纯化。2分离筛选初筛(透明圈法):取不同发酵时间液态醋20mL,加入50mL增殖培养基,30℃增殖培养3～4d。稀释至10-4～10-7倍,各取0.2mL,涂到平板分离培养基,30℃培养3d,待长出菌落后,挑菌落较小、透明圈较大、边缘整齐的单菌落移植试管培养。复筛:取经初筛培养成的斜面菌落,接入液体试管(装液量10mL、酒精体积分数3%),30℃培养24h后,接入500mL液体三角瓶(装液量40mL),接种量为1支试管接1只三角瓶。最后酒精体积分数为6%,30℃静止培养,每日测定酸度,选出产酸快、酒精转化率高的菌株并做醋酸定性试验。纯化:确定产酸快、酒精转化率高的较优菌株,反复纯化获得纯种。纯化方法同分离方法。（四）定性实验1产酸速度及酒精转化率经过反复分离筛选,初筛选出60多株透明圈较大菌株,移入试管培养;复筛选出2株产酸快、酒精转化率高的较优菌株，分别为醋酸28号、醋酸菌36号。这两株菌在酒精体积分数为6%的液体三角瓶中产酸情况如表1所(酸度以醋酸计)。由表1可见,醋酸菌28号和醋酸菌36号产酸速度均较快,3d即可氧化酒精80%左右。培养6d的醋酸菌2号和醋酸菌36号的酒精转化率分别为89.0%和92.8%。2酒精度对产酸的影响接醋酸菌28号和醋酸菌36号于液体三角瓶中,酒精体积分数分别为3%、5%、7%、9%、11%、13%,30℃静止培养,产酸情况如表2所示(酸度以醋酸计)。可见,醋酸菌36号要比醋酸菌28号更耐高浓度酒精。3温度对产酸的影响接醋酸菌28号、醋酸菌36号于液体三角瓶中,酒精体积分数为3%,分别在25、30、35、40℃下静止培养6d,产酸情况如表3所示(酸度以醋酸计)。醋酸菌28号、醋酸菌36号耐高温情况相差不大,二者最适发酵温度均在30℃左右。4食盐浓度对产酸的影响接醋酸菌28号、醋酸菌36号于液体三角瓶中,酒精体积分数为3%,分别加入不同量食盐,30℃静止培养6d,产酸情况如表4(酸度以醋酸计)。醋酸菌28号、醋酸菌36号在食盐浓度0.8%下仍能产酸。5产醋酸定性试验将上述斜面菌种接种于含0.03乙醇,1%酵母膏,1.5%碳酸钙的培养液中,30℃静置浅层培养3到5天后,取除去菌体的培养液,2.5mol/lNaOH溶液中和至pH7.0。加5%氯化铁溶液5一6滴,形成红褐色沉淀者为产醋酸细菌。（五）结论通过菌种分离筛选获得的醋酸菌28号、醋酸菌36号2株菌产酸均较快醋酸菌36号对酒精转化率更高、耐酒度上更好一些。用醋酸菌36号纯种进行果汁发酵产生苹果醋,其成品醋主要理化指标较为理想（六）可行性分析醋酸菌是专性好氧细菌,其氧化乙醇为乙酸的作用是由于它的细膜上含有高活性的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶复合体，所以当在培养基中加入乙醇时。醋酸菌能氧化乙醇为乙酸，进而根据相应的生理生化反应，可以用于分离筛选优良醋酸菌。本实验进行的一切胜利指标上的测定都是比较科学合理的，在现实生活中具有可行性。（七）参考文献1恒顺调味品研究所.镇江香醋醋酸菌的分离筛选报告.江苏副食调味品,1990,(1):9～122上海市酿造科学研究所.发酵调味品生产技术:下册.北京:轻工业出版社,1979.233～2423中国科学院微生物研究所菌种保藏手册编写组.菌种保藏手册.北京:科学出版社,1980.2224顾善,仲元.对日调味品技术考察报告.江苏副食调味品,1988,