人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠

中国组织工程研究第20卷第32期2016–08–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust5,2016Vol.20,No.32P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·赵雅培，女，1974年生，河北省深泽县人，汉族，2007年河北医科大学毕业，硕士，副主任医师，副教授，主要从事超声诊断，擅长血管超声诊断方面的研究。中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)32-04838-07稿件接受：2016-06-20人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠赵雅培1，刘翠景1，杨翠英1，范士英2，张立建1，赵艳琴1，谢迎新1(1河北医科大学第二医院东院区超声科，河北省石家庄市050000；2河北医科大学第二医院检验科，河北省石家庄市050000)引用本文：赵雅培，刘翠景，杨翠英，范士英，张立建，赵艳琴，谢迎新.人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠[J].中国组织工程研究，2016，20(32):4838-4844.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.019ORCID:0000-0003-3441-7819(赵雅培)文章快速阅读：文题释义：尿源性干细胞：是从尿液中分离培养出的具有良好增殖活性和多向分化能力的成体干细胞，研究表明其具有间充质干细胞的各种生物学特性，因尿源性干细胞具有来源不受限、制备过程简便、安全无创和成本低等特点，故其成为了细胞替代治疗和组织工程研究中更为理想的种子细胞来源。检测移植入受体体内干细胞的3种方法：①Y染色体检测，即于雌性受体(动物或人)组织中检测到雄性供体来源的Y染色体阳性细胞；②绿色荧光蛋白转基因标记检测；③LacZ(β-半乳糖苷酶染色)标记检测。摘要背景：尿源干细胞最可能的来源是肾脏组织，可能更加适应肾脏微环境，这为肾脏疾病的治疗提供了新思路。目的：探讨人尿源干细胞对慢性肾病模型大鼠的治疗作用。方法：收集健康人新鲜尿液，提取人尿源干细胞，进行体外培养。20只SD大鼠制备慢性肾病模型，实验组肾皮质内注射人尿源干细胞悬液，对照组肾皮质内注射生理盐水，另外取10只健康大鼠作为正常组。通过检测3组大鼠血清肌酐及肾小球滤过率判断尿源干细胞对肾功能的改善作用，并对3组大鼠肾脏进行组织形态学评估。结果与结论：①尿源干细胞对肾功能具有改善作用，与对照组比较，实验组大鼠血清肌酐降低、肾小球滤过率升高；②尿源干细胞对肾脏的组织学形态有改善作用，与对照组比较，实验组大鼠肾脏组织中CD68阳性细胞明显减少，肾脏间质炎性细胞浸润减轻；③结果表明，人尿源干细胞对慢性肾病模型大鼠肾功能存在修复作用。关键词：干细胞；移植；人尿源干细胞；慢性肾病；大鼠；干细胞移植；血清肌酐；肾小球滤过率；CD68主题词：肾病；尿；干细胞移植；组织工程基金资助：河北省医学科学研究重点课题计划指令性课题(ZL20140062)人尿源干细胞移植治疗慢性肾病人尿源干细胞培养慢性肾病大鼠模型(1)血清肌酐水平降低、肾小球滤过率升高；(2)肾组织学形态明显改善；(3)肾组织中CD68阳性细胞明显减少肾皮质内注射移植人尿源干细胞能促进慢性肾病模型大鼠肾功能恢复赵雅培，等.人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4839(1DepartmentofUltrasonography,EastBranch,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,HebeiProvince,China;2DepartmentofLaboratory,SecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,HebeiProvince,China)AbstractBACKGROUND:Urine-derivedstemcellsaremostlikelytocomefromthekidneytissue,andtherefore,thesecellsaremoreadaptabletokidneymicroenvironment,providinganewoptionforthetreatmentofkidneydiseases.OBJECTIVE:Toexplorethetherapeuticefficacyofhumanurine-derivedstemcellsonchronicnephropathyrats.METHODS:Thefreshurinesamplesofhealthypeoplewerecollected,andthenhumanurine-derivedstemcellswereextractedandculturedinvitro.TwentySprague-Dawleyratswereusedtopreparechronicnephropathymodels,andgiveninjectionofhumanurine-derivedstemcellsuspension(experimental)ornormalsaline(control)intotherenalcortex,respectively.Another10healthyratswereusedascontrols.Therapeuticeffectsonrenalfunctionwereassessedbydetectionofserumcreatininelevelandglomerularfiltrationrateinthethreegroups.Thekidneytissuesofratsweretakenandobservedhistomorphologicallyineachgroup.RESULTSANDCONCLUSION:Humanurine-derivedstemcellswerefoundtoremarkableimproverat’srenalfunctionaswellasreducethehistomorphologicalchangesinthekidneytissuesofrats.Comparedwiththecontrolgroup,theserumcreatininelevelwasdecreasedwhiletheglomerularfiltrationratewasincreasedsignificantlyintheexperimentalgroup;CD68expressionandinfiltrationofinterstitialinflammatorycellswerealsomarkedlyreducedintheexperimentalgroup.Toconclude,humanurine-derivedstemcellscanimprovetherenalfunctionofchronicnephropathyrats.Subjectheadings:Nephrosis;Urine;StemCellTransplantation;TissueEngineeringFunding:theKeyMedicalResearchProjectofHebeiProvince,China,No.ZL20140062Citethisarticle:ZhaoYP,LiuCJ,YangCY,FanSY,ZhangLJ,ZhaoYQ,XieYX.Humanurine-derivedstemcelltransplantationforthetreatmentofchronickidneydiseaseinrats.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(32):4838-4844.0引言Introduction慢性肾病是一种常见肾脏疾病，临床诊断为肾小球肾炎、肾病综合征、肾炎、糖尿病肾病等，当这些病发病时间超过3个月，尿液和血液等指标出现异常，病理学、造影学发现异常或者肾小球滤过率低于60%等，都称为慢性肾病。如果患者没有得到及时有效治疗，常发展成慢性肾功能不全、肾衰竭，甚至心血管系统等并发症，最终导致尿毒症的形成。调查显示，美国慢性肾病患者约有2700万，中国慢性肾病患者40岁以上人群患病率大于10%，发病率逐年上升[1-3]。对于那些发展为终末期肾病的患者主要治疗方法只有透析和肾移植，给患者家庭和社会带来沉重负担。动物实验研究显示，胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞等应用于肾脏疾病治疗具有良好前景[4-8]。研究发现，尿源干细胞表达间充质干细胞的表面抗原，在一定条件下可分化为不同种类的细胞[9]。由于其来源于经过肾脏的尿液中，可能对慢性肾病的改善更加明显[10]。实验将制备好的人尿源干细胞单细胞悬液移植入慢性肾病SD大鼠两侧肾脏皮质内，观察人尿源干细胞对慢性肾病大鼠的治疗作用。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机分组对照动物实验。1.2时间及地点于2014年2月至2015年4月在河北医科大学第二医院实验室完成。1.3材料1.3.1尿液标本标本采集前均获得供者的知情同意，年龄20-30岁健康成年男性10例，取样前消毒尿道口，无菌条件下收集中段尿液约150mL/例，分装于50mLEP离心管中。该研究得到河北医科大学第二医院伦理委员会批准。1.3.2实验动物9周龄SPF级雄性SD大鼠30只，体质量(230±20)g，购于南方医科大学实验动物中心，合格证书号为SCXK粤2014-0015，购回后适应性喂养1周，赵雅培，等.人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠P.O.Box10002,Shenyang110180温度(25±2)℃、湿度(50±5)%。实验过程中对动物处置均符合动物伦理学要求[11]。1.4实验方法1.4.1人尿源干细胞的分离、培养及移植用无菌尿液收集器收集中段尿约150mL，分装于50mLEP离心管中，置于冰盒中保存，以2000r/min低温离心3min，弃去上清液，加入PBS洗涤沉渣，再以2000r/min低温离心3min，弃去上清液，加入24mL预热(37℃)的尿源细胞培养基悬浮细胞，吹打混匀后，将细胞悬液加入24孔板，1mL/孔，放置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中孵育48h，每孔分别加入1mL预热(37℃)的尿源细胞培养基，此后隔天换液，于倒置相差显微镜下观察人尿源干细胞生长状态。待24孔板内细胞达到约90%融合时，去除培养液，加入少量无菌PBS轻轻洗涤2次，弃去缓冲液，加入37℃预热的0.25%胰蛋白酶溶液，于培养箱内进行消化，倒置相差显微镜下观察到细胞间隙增加，成片松散脱落，细胞缩成圆形，立即加入2倍量的培养液终止消化，用吸管轻轻吹打将细胞吹散成悬浮细胞，置于EP离心管中，以2000r/mi